关键词：猪流感病毒；分离；H1N1
猪流感(Swine influenza，SI)是由A型流感病毒引起的一种猪的急性呼吸道传染病。流感病毒属于正黏病毒科，包括A、B、C、托高土病毒属4个属。A型流感病毒可以感染多种动物，包括许多禽类和哺乳动物。B型和C型病毒似乎只能从人体内分离到，虽然也从猪体内分离到了C型流感病毒[1]，但感染猪的主要还是A型流感病毒。早在1918年，美国、匈牙利和中国就有关于猪流感的报道，这与1918年西班牙人类大流感的时间一致。目前该病呈世界分布，但主要以地方性流行为主。单纯的SIV感染表现为发病率高(100%)。病死率低(约5%)的特点，其严重程度与流行毒株、猪的日龄和健康状况、环境条件及细菌性继发感染相关。猪流感不仅危害猪体健康，同时影响育肥猪的上市时间，并增加饲养成本，对养猪" target="_blank" href="http://cj.zhue.com.cn/jinrijujiao/">养猪业造成的损失不容忽视。
猪流感病毒不仅对猪体健康和养猪业危害大，在整个流感病毒的遗传进化和生态分布中都占有重要地位，特别是对人类健康具有潜在的威胁。虽然近年来发生了多起禽流感病毒感染人并引致疾病乃至死亡的事例[2]，但一般认为流感病毒具有种属特异性，即禽流感病毒很难突破种间屏障直接感染人[34]。2006年底，无锡某猪场发生不同程度的呼吸系统疾病，本研究对从该猪场分离的一株具有血凝特性的毒株H1N1，利用RTPCR扩增HA基因。经遗传分析表明，该分离株属古典型H1N1，极可能在人畜禽间相互传播。
1 材料与方法
1.1 材料
新城疫病毒La Sota株、禽流感病毒H9N2、猪流感病毒H3N2、人源流感病毒PR8株由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所惠赠。A/Swine/Wuxi/1/07(H1N1)病毒株分离于江苏无锡地区某发病猪场鼻拭子样品；SPF鸡胚(9日龄)购自山东SPF鸡胚孵化场。
1.2 载体与主要试剂
pGEMT easy载体、T4 DNA连接酶、RTPCR试剂盒购于美国Promega公司；凝胶回收DNA试剂盒购于德国QIAGEN公司；EcoRⅠ酶购自MBI公司。
1.3 HA基因的扩增
1.3.1 病毒RNA提取 通过SPF鸡胚扩增上述病毒，收集尿囊液，经浓缩后采用Trizol试剂提取各病毒RNA。吸取250 μL病毒液至1.5 mL用DEPC水处理过的Eppendorf管中，加入750 μL Trizol试剂，混匀后置15 ℃～30 ℃作用5min；加入0.2 mL的氯仿，用手剧烈摇15 s，室温静置5 min；于4 ℃ 以12 000 r/min离心15 min；取上清于另一个Eppendorf管中，加入500 μL的异丙醇，室温作用10 min，于4 ℃以12 000 r/min离心10 min；弃上清，加入750 mL/L的乙醇1 mL漂洗2次；干燥后用DEPC水重悬，－20 ℃保存备用。
1.3.2 分离株亚型鉴定 分别采用Choi等建立的鉴别H1和H3亚型的RTPCR法对分离株进行亚型鉴定。鉴别H1和H3亚型的两套引物序列为：HF1：5′GGGACATGTTACCCAGGAGAT3′，HR1：5′GCATTGTATGTCC AAATATCCA 3′，HF3：5′TATGCCTGGTTTTCGCTCAA3′，HR3；5′TTCGGGATTACAGTTTGT TG3′。第一套引物扩增片段长度为1 006 bp，为H1亚型特异性；第二套引物扩增片段长度为663 bp，为H3亚型特异性。PCR反应参数为：94 ℃ 50 s，54 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min 30 s,30个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。
1.3.3 HA的引物设计 根据已发表的猪流感H1N1 HA序列设计上游引物P1：ATG AAA GCA AAA CTC CTG ATC CTG T；下游引物P2：CAG ATG CAT ATT CTA CAC TGC AAA，以尿囊液提取的RNA为模板扩增HA基因。
1.3.4 HA全基因片段的RTPCR 按Promega
公司的AMV RTPCR试剂盒操作说明书进行，反应体积为25 μL。反应混合物包括RNA模板5 μL，上下游引物各0.1 μmol/L，AMV逆转录酶2.5 U，Taq DNA聚合酶2.5 U，RNA酶抑制剂20 U，dNTP混合物1 mmol/L，MgCl2 2.5 mmol/L。进行反应时，首先逆转录反应50 ℃ 30 min，然后94 ℃ 2 min，使逆转录酶失活，再进行常规PCR。
1.4 重组质粒的构建及鉴定
PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳，分别利用QIAGEN公司凝胶回收试剂盒回收，与pGEMT easy载体按1∶8(摩尔比)于4 ℃连接12 h，转化DH5α，用AIX(含有0.1 mg/mL Amp， 0.1 mg/mL IPTG，0.02 mL Xgal)LB平板蓝白斑筛选，提取白斑的质粒DNA，用Eco RⅠ酶切鉴定，筛选阳性克隆。
1.5 序列分析
通过DNA Star软件和BlastN软件分析HA基因的遗传特性，分析该分离株的遗传背景和来源。
2 结果
2.1 HA基因RTPCR扩增结果
通过RTPCR方法的扩增结果可见，该病毒为H1亚型流感病毒，利用H3的特异性引物不能扩增获得HA，而通过H1特异的引物进行扩增，则可见1.7 kb的阳性条带，将该片段克隆入T载体中，用EcoRⅠ单酶切，将阳性的克隆测序。结果显示，该场分离的病毒为H1N1分离株(图1)。
1.THA酶切鉴定结果；2.DNA标准10 000
1.THA digested by EcoRⅠ；2.DNA Marker 10 000
图1 HA基因克隆入T载体
Fig.1 Subcloning of HA gene into pGEMT easy vector
2.2 遗传进化分析
通过RTPCR扩增H1N1 HA基因，将其克隆入T载体，经测序鉴定，与GenBank中其他分离毒株进行比较，发现该分离株为人型H1N1，与古典H1N1 PR8毒株同源性最高(图2)。
图2 系统进化树分析
Fig.2 Analysis of the phylogenetic tree
3 讨论
世界各地流行的SIV包括3种主要的亚型，即H1N1、H3N2和H1N2亚型，其中包括不同的基因型，即古典猪H1N1、类禽H1N1、类人H3N2、基因重配的H3N2以及多基因型的H1N2亚型。此外，H1N7、H4N6、H9N2、H5N1和H3N3等亚型病毒也从猪体内分离到，但都未在猪群中引起传播。我国近年来不断有SIV分离的报道，但SIV在我国的流行情况仍然不清楚[57]。
通过对猪体内分离到的H1N1流感病毒的HA进行进化树分析，表明古典型H1N1 SIV，与类人H3N2流感病毒一样，长期存在于我国猪群中。早在1976到1982年，中国南方猪群中SIV监测发现，古典H1N1 SIV和类人H3N2病毒共同存在。郭元吉等[89]从北京某猪群中分离到古典猪H1N1病毒，这是在中国大陆的首次报道。Guan Y等[10]在中国猪群中发现了类禽H1N1病毒，但没有造成流行。本研究从无锡市猪群中分离到1株SIV，进一步证实人型H1N1亚型流感存在于猪群中，表明我国猪群中的流感病毒有感染人类的可能性。因此，在猪群中，迫切需要建立长期有效的监测。
猪被认为是禽、人流感病毒的中间宿主和基因混合器。猪由于呼吸道上皮同时具有2种类型的流感病毒受体[4]，因此人和禽流感病毒都可以感染猪，这就为禽流感病毒感染人提供了两种可能。其一，禽流感病毒在猪体适应后获得了感染人的能力；其二，这为禽流感病毒与人流感病毒发生基因重配提供了机会，这种含有禽流感病毒基因的重配病毒可能感染人并引起流行。此外，猪也可能成为人流感病毒(H1N1和H3N2亚型)的贮存宿主，一些人流感病毒亚型在人群中消失后，可以在猪群中持续存在，成为人流感的潜在传染源[5]。所以猪流感也是一种值得重视的人兽共患病。
近年来，猪呼吸道疾病在我国许多地方猪场频繁发生，症状与国外流行的呼吸道疾病(porcine respiratory disease complex， PRDC)相似，病原较为复杂。在对SIV的研究中，许多流感病毒是从外观健康的猪体内分离到的[5,10]，SIV一旦感染猪群就很难根除，SIV可以在猪群中持续存在[5]。本研究采集的样品来自患病猪群，在SIV分离阳性的猪群中可能还存在其他病原的混合感染，如猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)等。而我国外观健康猪群中的SIV流行情况如何，则有待进一步研究。
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