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口蹄疫VPl基因的克隆表达及其间接ELISA方法

时间:2009-02-27 来源:互联网 作者:蒲 静 等 点击:   网友评论  分享到微博

        口蹄疫是由口蹄疫病毒引起偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病,被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病。口蹄疫在全球范围内传播甚广,欧、亚、非和南美的一些国家和地区都曾经成为口蹄疫的重灾区。该病传染性极强,危害严重。2005年起,我国部分地区发生了亚洲工型口蹄疫疫情,由于口蹄疫血清型众多,病原容易变异,给口蹄疫的防制带来了巨大困难。

         亚洲l型口蹄疫病毒基因组全长8.5 kb,结构蛋白分为VPl~VP4四种多肽。研究表明,VPl蛋白大部分暴露在病毒的表面,是决定病毒抗原性的主要成分。VPl蛋白的141~160位及200~ 213位氨基酸残基富含FMDV的抗原表位,能够诱导动物产生中和抗体,也是抗原性的高变区[2]。Suryanarayana等证明,VPl表达产物及其抗体可作为诊断用试剂。本研究利用VPl蛋白富含抗原表位,具有型特异性这一特点,运用原核高效表达系统进行亚NI型口蹄疫病毒VPl结构蛋白的表达,旨在获得大量纯化的重组VPl蛋白,建立FMDV型特异性ELISA诊断方法,为开发FMDV诊断试剂奠定基础。

1材料与方法

1.1病毒、菌株与载体亚洲工型口蹄疫病毒As一1/PK一1/2005毒株核酸、大肠埃希菌BL21(DE3)plysS、感受态细胞Topl0和原核表达载体pET30a均由本实验室保存。

1.2  主要试剂  Taq DNA聚合酶、AMV反转录酶购自Promega公司;FMDV各型标准阳性血清和亚洲工型口蹄疫抗体液相阻断ELISA检测试剂盒购自中国农业科学院兰州兽医研究所;HRP标记的重组蛋白A购自北京博奥森公司;His·Bind蛋白纯化试剂盒购自Novagen公司。

1.3重组表达载体的构建与鉴定  根据GenBank下载的亚洲I型口蹄疫病毒全基因及VPl基因参考序列,选择高保守区,设计了l对包含VPl全基因的引物,并引入酶切位点Sal工和BglⅡ序列,这对引物命名为Pl、P2。Pl:5,-CGA AGA TCT GAC TAC CAC CAC TGG CGA GTC一3 ';P2:5 '一CGA GTCGAC GTT ACA AAG TCT GTT TCT CAG GTG一3’。以口蹄疫病毒As一1/PK一1/2005核酸为模板,用Pl和P2引物进行PCR扩增。将获得的VPl基因片段双酶切后与pET30a载体连接,转化BL21(DE3)plysS感受态细胞,Sal工/BglⅡ双酶切鉴定为阳性的菌液测序,正确的重组质粒命名为pET30a—VPl。

1.4重组表达质粒的诱导表达  将测序正确的重组菌单菌落接种含有30 m9/mL卡那霉素的LB液体培养基中37℃培养至对数生长期,然后加入终浓度为l mmol/L的IPTG,37℃诱导表达。分别于诱导后第2、3、4、5小时各收集菌液1 mL备用。

1.5表达产物的检测、鉴定和纯化将分步收集的表达菌样品用l2%分离胶进行SDS—PAGE检查,并将蛋白电泳的目的蛋白条带转移到硝酸纤维素膜上,用含l%OVA的PBST封闭,以亚洲l型FM-DV阳性血清作为一抗,HRP标记的重组蛋白A为二抗,用HRP—DAB显色试剂盒观察。将超声破碎后的诱导表达菌分别取上清和沉淀用于SDS—PAGE分析。最后按照His·Bind蛋白纯化试剂盒的说明书对重组蛋白VPl进行亲和层析纯化。

1.6 VPl间接ELISA检测方法的初步建立

1.6.1  摸索VPl间接ELISA的工作条件  棋盘滴定法确定重组蛋白VPl的最佳包被浓度和被检血清稀释度,确定封闭液,二抗等ELISA条件。通过检测40份进口猪、牛阴性血清(中和试验检测为FMDV阴性,由本实验室保存),确定判定结果的阴阳性临界值。

1.6.2  VPl间接ELISA对不同血清型口蹄疫阳性血清的检测  按照建立好的间接ELISA条件,对亚洲l型、A型、0型和C型口蹄疫阳性血清进行检测,验证亚洲工型VPl重组蛋白是否能够特异性的仅与亚洲I型阳性血清反应。

1.6.3  VPl间接ELISA对血清样本的检测  按照建立好的间接ELISA条件,检测50份牛血清(某养殖场Asia l型FMD灭活疫苗免疫后的监测血清,本实验室保存),并将检测结果与中国农业科学院兰州兽医研究所生产的亚洲I型口蹄疫抗体液相阻断ELISA试剂盒进行比较。

 


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