抗猪流行性腹泻病毒卵黄抗体（PEDV-IgY）及其特性研究

摘要:  猪流行性腹泻病毒(PEDV)分离株在仔猪肠道内增殖后收获小肠组织提纯并浓縮病毒,与弗氏佐剂乳化后免疫待开产蛋鸡；同时将在Vero细胞中适应增殖的PEDV病毒提纯浓縮后作为检测抗原。利用琼脂扩散试验检测免疫鸡的血清抗体和卵黄抗体效价变化动态,结果显示血清抗体较卵黄抗体出现早，提前1周到达峰值，同时其抗体效价下降也快。将抗体效价≥1:64的卵黄收集,经氯仿抽提和硫酸胺沉淀后制备提纯卵黄抗体液，经SDS-PAGE电泳显示该提纯卵黄抗体主要由分子量分别为66kd的重链和35kd的轻链组成。攻毒治疗试验结果显示卵黄抗体治疗组和对照组死亡率分别为16.7%和100%，表明该卵黄抗体对猪流行性腹泻病毒所致的仔猪腹泻具有明显的治疗效果。

关键词：猪流行性腹泻病毒（PEDV）, 卵黄抗体（IgY），仔猪腹泻

猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）为冠状病毒科的成员，与猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）感染引起的临床症状和病理变化极为相似，该病原可致各种年龄的猪发病，其特征症状为呕吐、腹泻和脱水，本病呈地方流行性，仔猪有较高的发病率和死亡率，给某些养猪场">养猪场" href="http://js.zhue.com.cn/yangzhujishu/zhudehuanjing/200808/26-42385.html" target="_blank">猪场带来严重经济损失^[1]。

对曾发生过该病的猪场或接种过PEDV弱毒疫苗的妊娠母猪，仔猪主要通过初乳获得对PEDV的抵抗力，母源抗体消失后的断奶仔猪常出现顽固性腹泻，而一旦暴发猪流行性腹泻，目前尚没有特别有效的防治措施。鉴于卵黄抗体与初乳作用机理相似，都是通过被动免疫途径达到对仔猪的保护，因而研制抗PEDV卵黄抗体^[2]，应用于发生PED的猪场，对防止PED的流行及降低该病造成的损失将具有重要意义。

本试验利用一株猪流行性腹泻病毒分离株，制备免疫原免疫产蛋鸡，收集高效价卵黄，分离提纯卵黄抗体，用于PED的治疗和预防，从而为防治PED研制一种疗效显著、使用方便、易于大量获得且无环境污染的生物制剂。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1病毒和细胞   猪流行性腹泻病毒分离株来自中国农业大学兽医学院；增殖病毒用Vero细胞，由本室保存。

1.1.2试验试剂    培养细胞用培养基和血清购自GIBCO BRL公司；弗氏佐剂购自中国兽药监察所。

1.1.3试验动物    120日龄待开产非免疫蛋鸡,购自中国兽药监察所；1日龄未吃初乳仔猪购自京郊某猪场。

1.2方法

1.2.1PEDV在猪体内增殖   1日龄未吃初乳仔猪人工哺乳，PEDV口服攻毒，出现腹泻24小时后剖杀，取小肠组织用于提取和纯化PEDV。

1.2.2PEDV提取与纯化   刮取小肠内壁组织及内容物充分研磨，加10倍体积PBS稀释，反复冻融3次后离心，取上清液用PEG6000进行纯化并浓缩，经0.22μm微孔滤膜过滤后即为提纯PEDV^[3]。

1.2.3 PEDV在细胞上增殖   培养Vero细胞，细胞单层长至75%以上时，接种提纯PEDV并加入50μg/mL胰酶以助病毒吸附，若72小时后细胞病变(CPE)不明显，则收获细胞盲传下1代，盲传至第5代出现CPE，此时收获病变细胞，反复冻融3次后离心取上清液，最后对病毒上清液进行浓缩备用^[2，4，5]。

1.2.4免疫   浓縮病毒液经0.5%甲醛灭活后与等量弗氏佐剂乳化作为免疫原。首免前5日用破伤风类毒素等混合制剂对每只鸡胸肌多点注射0.5mL，以刺激机体免疫反应。首免免疫剂量1mL，胸肌多点注射；分别间隔两周进行二免和三免，免疫剂量增至1.5mL和2mL。

1.2.5抗体效价检测    二免后1周开始，每周采血和收集卵黄，应用琼脂扩散试验检测血清抗体和卵黄抗体效价，比较二者的变化动态，至卵黄抗体效价达到1∶64时收集卵黄。

1.2.6卵黄抗体提纯    无菌收集高效价卵黄，先后加入2倍体积生理盐水和1/2体积氯仿充分振荡，离心后收集上清液，先后用50%和36%硫酸胺沉淀卵黄抗体，最后溶于与原卵黄量等体积的生理盐水中，4℃透析24小时，即为提纯卵黄抗体。

1.2.7提纯卵黄抗体检测    应用BCA Protein Assay Kit（购自Pierce公司）测定卵黄抗体的蛋白浓度；卵黄抗体纯度通过SDS-PAGE蛋白质电泳检测；而卵黄抗体的效价用琼脂扩散试验检测。

1.2.8卵黄抗体抗病毒活性测定   刚出生未吃初乳仔猪18头，采用人工哺乳，随机分成两组，治疗组12头，对照组6头，适应24小时后攻毒，仔猪开始出现腹泻时治疗组口服提纯卵黄抗体液，每猪每次2ml，每日3次；对照组口服等量生理盐水。逐日观察，以粪便指数和死亡率两个指标反映治疗组和对照组差异是否显著。粪便指数按照Sherman等^[6]制定的标准判定，即0分为正常，粪便固态成形；1分为轻度腹泻，粪便稀软成形；2分为中度腹泻，粪便呈黄色水样；3分为重度腹泻，粪便呈水样喷射。

2结果

2.1血清抗体和卵黄抗体效价检测    结果显示，二免后1周血清抗体较卵黄抗体效价高，血清抗体效价上升快，至三免后2周达到峰值，之后其效价快速下降；而卵黄抗体效价上升较慢，三免后3周达到峰值，之后其效价缓慢下降，较血清抗体维持2.2卵黄抗体浓度、纯度和效价测定    卵黄经氯仿去脂后蛋白浓度为14.5mg/mL ,经硫酸胺沉淀并透析后蛋白浓度为10.2mg/mL;SDS-PAGE蛋白质电泳(图2)显示不同方法处理后卵黄抗体纯度明显提高，卵黄抗体由分子量约为66kd和35kd的重链和轻链组成，与文献报道一致^[7]；氯仿去脂后琼扩效价为1∶8，而透析后上升至1∶64。