〔PCR步骤〕
标准的PCR过程分为三步：
1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下， 氢键断裂，形成单链DNA
2.退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。
3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。
每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。
现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。
〔PCR检测〕
PCR反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。荧光素（溴乙锭）染色凝胶电泳是最最常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的，因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行，成为了主流检测方法。近年来以荧光探针为代表的检测方法，有逐渐取代电泳法的趋势。
聚合酶链式反应（polymerase chain reaction ,PCR）
三步：
1 变性：模板DNA加热变性
2 退火 引物与它的靶序列发生退火，引物DNA量多，使引物和模板在局部形成杂交链
3 延伸 4种dNTP 与 Mg2+ 存在的条件下，DNA合成酶催化以引物为起始点，按5'-3'方向进行延伸。
上面三步为一个循环，可使拷贝数到达2*Ｅ－6-2*Ｅ－7
PCR 产物一段双链DNA，是由它的末端引物的5’端决定的。
PS：
1.首轮扩增，其产物是大小不均一的DNA分子。长度应大于两引物之间的长度。
在第二个循环中，由于5'固定，其产物长度就由等于两引物之间的长度。所以几十个循环后就会产生
大量的两引物之间序列。
引物设计：
1，长度15~30个核苷酸，最多到50个核苷酸左右。
2, 尽量避免嘌呤和嘧啶堆积的现象。（其实有时很难避免，不是很重要）。
3,引物内部不应该形成二级结构，如果引物中有酶切位点时，就会出现引物二聚体。（一般不是很重要）
PCR的反应条件
１，dＮＴＰ浓度过高会加快反映速度，但同时还可以增加碱基的错误掺入率。
２， 引物浓度过高会引起错配和非特异性产物扩增。
３，ＴａｑＤＮＡ聚合酶浓度过高会引起错配和非特异性产物扩增，低则合成产物量减少。
ＴａｑＤＮＡ聚合酶无校正功能，掺入错误率达2*E-4个核苷酸，一个３０个循环的扩增反应0.1％-0.25％总错误率。
４， 在９０～９５度下可使整个基因组的ＤＮＡ变性为单链。一般９４～９５度３０～６０s。时间过长使
ＴａｑＤＮＡ聚合酶失活和dＮＴＰ破坏增多。
５，ＤＮＡ很快冷却到４０～６０度使引物和模板结合。引物长度在１５～２５时退火温度
Ｔｍ＝４（Ｇ＋ｃ）＋（Ａ＋Ｔ），一般在４５～５５度，温度低容易退火但特异性低；温度高，不容易退火但特异性高。退火时间３０秒。
６，延伸温度一般在７０～７５度这是ＴａｑＤＮＡ聚合酶活性最高（１５０个／Ｓ），当引物在１６个碱基以下时可采用缓慢升高温度到７０～７５度的方法，使在低温下就开始合成。一般<１ＫＢ时间１分钟即可。当〈１ＫＢ时在较后的循环中延长扩增时间。
７循环次数２５～３０次。
无产物时：
１，取１０ul扩增混合液作模板在进行ＰＣＲ扩增。
２，增加ＴａｑＤＮＡ聚合酶浓度
３，增加循环次数
４，降低退火温度
５，加靶ＤＮＡ量
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