目的 探讨大量分离乳猪肝细胞的方法.
方法 用体外灌流装置,EDTA和胶原酶两步灌流法消化分离乳猪肝细胞,综合方法观察判断肝细胞产量、活力、纯度及增殖能力.
结果 分离肝细胞的总产量达到109/肝,细胞活力94%～98%,纯度大于96%.分离乳猪肝细胞胞膜完整、细胞器丰富,培养肝细胞有活跃的增殖能力,培养上清中乳酸脱氢酶浓度仅有轻度升高,24h平均浓度17.8U/L±5.4U/L.。
结论 采用体外灌流装置两步分离法可获得大量高活性的乳猪肝细胞.
主题词 肝细胞;细胞分离;生物人工肝
0 引言?
目前，生物人工肝已成为肝衰竭治疗研究领域的热门课题，愈来愈引起人们的重视. 由于这种新型人工肝系统是以肝细胞为生物材料，因此，随着该研究的不断深入和广泛开展，迫切需要理想的细胞来源与制备技术[1]. 我们选择乳猪为对象，进行了大规模分离肝细胞的初步研究，现将结果报道如下.??
1 材料和方法?
1.1 材料 10日～15日龄健康乳猪5只，体重?1.2kg?～?2.0kg?，购自本地专业养殖场. 实验前4h断奶，送实验室清洁后备用. 主要试剂collagenase Ⅳ，EDTA，trypsin inhibitor等为Sigma产品. RPMI 1640培养液为Gibco产品，培养板为Nunc公司产品.?
1.2 方法 戊巴比妥钠(?30mg/kg) ip麻醉动物，固定，常规方法消毒皮肤，开腹，暴露门静脉并注入肝素钠100U～150U? 游离肝脏，于肝门处剪下取出，置自制的体外灌流系统(另文介绍)进行整体肝两步循环灌流. 前灌流液为含EDTA、无*"Ca, Mg离子的Hanks液，共500mL，其中300mL灌流后丢弃(因含大量红细胞)，另200mL循环使用，速度80mL/min～100mL/min，时间10min～15min. 第二步灌流液为胶原酶液，浓度0.5g/L，灌速50mL/min～70mL/min,时间10min. 两种灌流液在系统内均保持37℃～38℃. 灌流结束后，用剪刀划破肝包膜，剔除大块纤维结缔组织，收集细胞悬液，酌情再置37℃条件下消化10min～15min. 用RPMI 1640培养液终止消化，三层纱布过滤，50g反复离心3次～4次获取肝细胞. 在倒置相差显微镜下，使用血细胞计数板计数肝细胞产量，4g/L台盼兰拒染试验判断细胞活率. 低速离心收集新分离的肝细胞，0.3mol/L戊二醛固定4h，0.039mol/L锇酸后固定，乙醇脱水，Epon618包埋，超薄切片，柠檬酸铅染色，JEM_2000 SX透射电镜观察. 按1×105[wang 1]/mL接种于12孔培养板，使用相差显微镜观察细胞纯度和增殖生长能力，生化分析仪检测培养上清乳酸脱氢酶(LDH)含量.
2 结果?
用体外循环灌流装置对离体乳猪肝脏进行两步灌流，分离肝细胞的总产量为3.8×109～4.7×109/肝. 用台盼兰染色，肝细胞存活率94%～98%，接种24h，镜下连续计数每100个肝细胞中有非实质细胞2个～4个，肝细胞纯度达96%～98%. 肝细胞接种培养4h后，培养上清中LDH的平均值为13.2U/L±4.1U/L，24h后略有升高，平均浓度17.8U/L±5.4U/L，培养48h的LDH为23.7U/L±3.9U/L.。
图1 新分离肝细胞呈“葡萄样”. ×100?
图2 培养?24h?的乳猪肝细胞，镜下见大量双核细胞. ×200
新分离的乳猪肝细胞大多呈“葡萄样”相互粘附聚集，单个肝细胞较少见，聚集体内肝细胞数目可高达30个～40个以上(图1). 接种?1h?，肝细胞均已附壁，聚集体肝细胞先以堆积的形式附壁，随后逐渐铺开，向外伸展，最终呈典型的多边形单层贴壁生长. 培养?16h?～?20h?后，肝细胞开始活跃增殖，镜下见大量双核细胞，直至长满培养板，接触抑制为止(图2).?
电镜观察显示，分离乳猪肝细胞呈簇状分布，肝细胞具有正常肝细胞的超微结构特征，表现为肝细胞膜及核膜完整，胞质均匀一致，各种细胞器清晰可辨. 其中，线粒体较丰富，可见糖原颗粒. 电镜下所见肝非实质细胞数目与光镜情况相似.??
3 讨论?
迄今国外已有不少临床与动物实验资料显示，在人肝细胞来源困难的情况下，猪肝细胞可做为良好的细胞材料，用于生物人工肝，发挥解毒和生物合成功能，为暴发性肝衰竭患者提供有效的过渡支持[2]. 国内曾有研究者从乳猪肝组织中提取出促肝再生物质，治疗重症肝炎获得较好的疗效. 我们在以往的研究中发现，分离培养的胎肝细胞具有良好的体外增殖生长能力，能分泌生物活性物质，同样可起到保护肝损伤，治疗肝衰竭的作用[3]. 因此推测，如果使用培养的乳猪肝细胞，可使体外生物人工肝系统发挥较好的人工肝支持与治疗作用.?
已知制备大量高活性的肝细胞是生物人工肝系统的关键技术之一. 目前，肝细胞分离方法多采用Seglen的原位肝灌流法[4]，我们在多年的细胞培养工作中注意到，对于较大动物，尤其是难消化的动物肝(猪)，此法多有不便. 我们应用自制的体外肝灌流装置，对乳猪肝进行离体两步灌流，消化分离的猪肝细胞产量较多、活性好、纯度高，肝细胞具有正常肝细胞的超微结构特征，接种培养后增殖生长旺盛，从而为乳猪肝细胞用于生物人工肝提供了条件，有关研究正在深入进行之中.?
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