3．3理化联合激活
单一的激活剂或激活方式产生的激活率和发育率往往比较低，因此，目前不少学者普遍采用复合激活法来激活卵母细胞，但有关复合激活卵母细胞的效果比较的研究还比较少，不过还是取得了一定的进展，现已知道联合激活比单一激活的激活率和孤雌胚发育率都要高。李光鹏等报道，单独使用乙醇、电脉冲和氯化锶激活猪卵母细胞，其激活率分别为11．9％，61．3％，41．9％，而将它们与亚胺环己酮(CHX)联合使用，则其激活率分别升高到27．8％，81．1％，74．5％。吴中红等报道，离子霉素和乙基汞硫代水杨酸钠激活体外成熟的猪卵母细胞，其卵裂率和囊胚发育率分别为58．43％，l2．26％和61．60％，5．12％，而离子霉素与6-DMAP联合使用以及乙基汞硫代水杨酸钠与二硫苏糖醇(DTT)联合使用，则其卵裂率和囊胚发育率分别为68．81％，21．28％和86．67％，l9％。不同组合方式其激活效果也不同。在孤雌激活研究中，一般采用单纯电刺激激活的卵母细胞孤雌胚大多为单倍体，影响其发育，因此，为了提高孤雌激活胚胎的发育率，常常将电刺激与化学激活联合起来进行激活。由此可见，几种激活方法的联合使用，特别是能够诱发胞内钙波的激活方法与蛋白质磷酸化抑制剂联合使用，不但可以提高卵母细胞的激活率，而且还能促进原核的形成和孤雌胚胎的发育率。
4影响卵母细胞孤雌激活效率的因素
哺乳动物卵母细胞孤雌激活受多个方面因素的影响，最主要的是受激活方法和激活剂的控制，不同的激活方法和激活剂的选择，对卵母细胞的孤雌激活率、卵裂率及孤雌发育率均有较大程度的影响。其次，卵母细胞的成熟质量对其孤雌激活率也有重要影响，一般来讲，成熟质量越好的卵母细胞其孤雌激活率也就越高，孤雌激活胚的发育率也就越高，所以尽可能的优化卵母细胞体外成熟培养的条件，提高卵母细胞体外的成熟的质量可提高体外激活效果。另外，卵母细胞体外成熟时间长短对卵母细胞孤雌激活也有一定程度的影响，体外成熟培养时间的延长，可引起老化卵的孤雌激活发生，在鼠、兔和牛的研究中，均发现随卵龄的增加激活率上升。张箐等也证实随着培养时间的延长，猪卵母细胞的卵裂率升高，但也并非是体外成熟时间越长越有利于体外受精和卵母细胞的激活：卵龄和激活的关系目前尚不完全清楚，有待进一步研究，可能是老龄卵母细胞CyclinB的降解途径对于细胞内Ca2+释放更为敏感所致。最后，卵母细胞激活过程中的培养液的选择、激活时间、激活温度等对卵母细胞的孤雌激活效果均有一定的影响。
5孤雌激活胚的的类型和体外发育
孤雌活化卵在一定的培养条件下可以开始卵裂并发育。正常受精时，MⅡ期卵母细胞将有一半的染色质以第二极体的方式排出，而在孤雌激活中，由于刺激因素、刺激强度、培养液类型和渗透压等等因素的不同往往使第二极体不能排出。因此，不同激活方法所形成的孤雌胚核型有差异。据研究表明，孤雌激活胚主要有以下5种核型：①激活卵第二极体未排出，由2个混合的单倍体原核组成一个二倍体核，称为杂合二倍体(heterozygous diploid)；②激活卵第二极体排出，发育成一个单倍体原核，称为均质单倍体(uniform haploid)；③激活卵第二极体排出，其雌原核加倍形成纯合二倍体(homozygous diploid)；④激活卵迅速分裂成2个均等的卵裂球，一个含雌原核，一个含第二极体，构成嵌合单倍体(mosaic haploid)；⑤激活卵激活后完成第2次成熟分裂时未排出第二极体，出现异常延迟分裂，构成嵌合单倍体。一般说来，孤雌胚可完成着床前的早期发育而形成形态正常的囊胚，体外条件下少数二倍体孤雌胚能发育至前羊膜腔甚至圆筒期，但是孤雌胚附植后发育到一定阶段便发生死亡，这可能是由于孤雌胚的细胞质和细胞核的功能存在一定程度的缺陷。对内源性基因和外源性导入基因表达特性的研究发现，来源于父母的基因在配子发生过程中发生修饰作用，从而使二者在发育中具有不同的功能。雌雄原核间存在染色体不同修饰说明雌雄原核间存在互补作用，它们的共同存在和不同表达对胚胎正常发育具有重要作用。试验证明，孤雌胚的成分限于形成原始外胚层系，即胚体和卵黄囊中胚层；雄核胚的成分限于形成滋养层和原始内胚层系。
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