两例新生仔猪流行性腹泻的诊断分析与防控建议

　　3.1 剖检病变

　　猪场A与猪场B发病仔猪的共同病变如下：脱水严重，皮肤无弹性（图2）。胃内充满未消化的乳糜（图7）。小肠空虚，肠壁变薄，常充满气体(图8)。肾脏表面散布着大量的针尖状出血点（图9），其它脏器无显著一致性病变。但猪场A多头仔猪的肾盂内有大量的结晶物（图10），可能与在哺乳母猪饲料中添加大量的磺胺类药物有关。

　　3.2 实验室诊断

　　3.2.1 病料采集。猪场A：采集以下病料 a.发病仔猪的小肠及其内容物；b：康复10～12天的后备母猪、育肥猪、1胎次母猪及经产母猪的粪便；c：正在发病的20日龄仔猪的粪便；猪场B：采集发病仔猪的小肠及内容物。疫苗样品：某品牌的流行性腹泻与传染性胃肠炎二联活疫苗。

　　3.2.2 病料预处理。仔猪小肠：剪取2cm肠管，剪碎，用PBS 以1:10的重量体积比进行稀释后匀浆，混合物于4℃ 2000g离心15min，收集上清液，立即提取RNA。粪便样品：用PBS 以1:10的重量体积比进行稀释后，涡旋混匀，该混合物于4℃ 2000g离心15min，收集上清液，立即提取RNA。

　　3.2.3 RNA提取与反转录：按照Geneaid公司病毒核酸提取试剂盒说明书提取RNA。根据宝生物工程(大连)有限公司RT-PCR试剂盒（TaKaRa Code：DRR036A）说明，采用10μL的反转录反应体系：5×RT Master Mix 2μL、Total RNA 4μL、RNase Free dH2O 4μL，混匀后，于PCR仪上进行反转录：37℃ 15min，85℃ 5 min。

　　3.2.4 PCR检测：1）PEDV的检测：根据GeneBank收录的PEDV M基因c DNA序列(登陆号JF690778.1)，设计合成引物，用于扩增PEDV的M基因片段(317bp)。引物序列如下：M1：5’-CATTCGGTTGTGGCGCAGGAC-3’(M基因297bp~317bp)；M2：5’-CGCCGTGTTTGGACCGGACATA-3’(M基因592bp~613bp)。采用20μL的PCR反应体系，混匀后进行扩增，扩增条件为:95℃预变性5min；95℃变性30s，59℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃终延伸5min。1%琼脂糖凝胶电泳观察结果。

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