猪传染性胃肠炎和流行性腹泻的鉴别

　　3．1．4血清学诊断TGEV抗体可通过数种不同的血清学方法检测，如间接荧光抗体试验、间接免疫过氧化物酶试验、放射免疫沉淀试验、病毒中和试验(VN)等，最常用的是VN试验。近年来研究发现，TGEV与猪呼吸道冠状病毒(PRCV)有一定相关性，血清中和试验(SN)特异性不强，可能出现假阳性。但在大批量检测或对群体进行监测时，可先用SN试验进行筛选，对阳性样品再用如阻断酶联免疫吸附试验(B-ELISA)等特异性很强的试验进行鉴定，使TGE抗体检测更为准确、快速。张净等用阻断ELISA和SN法对来自美国和中国的196份猪血清检测TGEV抗体，结果表明上述两种方法的检测结果存在显著差异。这些TGEV-SN阳性的血清(121头份)在用阻断ELISA检测PRCV抗体时有57头呈现阳性反应，这与Callebaut等(1989)的试验结果相一致，说明用SN法检测TGEV抗体时出现假阳性是由于PRCV与TGEV之间能呈完全中和交叉反应所致。周仲芳等[6]报道了用杆状病毒表达系统生产的TGE病毒纤突蛋白(S蛋白)建立了一种竞争ELISA检测猪TGE血清抗体，获得了较为理想的特异性和准确性。之后又报道了采用同样的重组抗原建立了一种间接ELISA用于TGE血清抗体的检测，同时由于在结果判定中采用终点滴定技术，使得检测结果的判定更直观和迅速。

　　3．1．5分子生物学诊断近年来，已发展了用核酸杂交探针技术如放射性探针膜杂交、放射性标记探针原位杂交来检测粪便样品，感染组织或感染细胞中的TGEV基因序列。用这些探针可区别不同的肠TGEV毒株。RT-PCR和非放射性标记物cDNA探针也已被用来区分TGEV和PRCV分离物。1997年，Woods和Paton等应用RT-PCR技术检测TGEV，结果证实RT-PCR是一种特异、敏感的TGEV诊断方法。李军等[8]建立了检测TGEV的RT-PCR方法。用此RT-PCR方法检测56份猪腹泻粪样，同时用夹心ELISA法作对照。结果显示，RT-PCR法检测的20份阳性粪样，用夹心ELISA法检测有14份呈阳性，两者的符合率为89。试验结果表明，RT-PCR法可检出1pg的TGEVRNA，比夹心ELISA法敏感性更高。最近KimL和ChangKO针对TGEV与PRCV二者S基因部分序列的差异性发展了一种将巢式PCR与RT-PCR相结合的方法即RT-巢式PCR法。

　　3．2PED诊断方法

　　3．2．1免疫电镜法IEM法既可用已知的PEDV高免血清检测未知抗原，又可用已知的PEDV抗原检测未知抗体。王继科等把抗原和抗体分别经10000g离心、免疫复合物又经12000g离心、最后在电镜下直接观察到典型的病毒粒子形成的免疫复合物，建立了具有3次筛选作用的改良的IEM法，具有简便、直观、快速和定性正确等优点。

　　3．2．2免疫荧光法用直接免疫荧光法(FAT)检测PEDV是可靠的特异性诊断方法，目前应用最为广泛。崔现兰等应用FAT检查病猪小肠的冷冻切片或小肠抹片，对PEDV人工感染仔猪的检出率为91.4，电镜观察阳性率为47.8。应用间接免疫荧光法(IFAT)对PED阳性猪血清的检出阳性率为89。林志雄等用适应于Vero、PK15等传代细胞株生长繁殖的PEDV-G1株建立直接免疫荧光法。该方法并不和猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒、轮状病毒和大肠杆菌等发生交叉反应。

　　3．2．3微量血清中和试验林志雄等建立了PED微量中和试验，采用适应于传代细胞生长的PEDVG1株，以PK15作指示细胞，48h判定。研究证实本方法检验准确、可靠，具有较高的敏感性，可用于流行病学调查。

　　3．2．4ELISA法ELISA法最大的优点是可从粪便中直接检查PEDV抗原，目前应用也较为广泛。陈茹等用分离纯化的PEDV抗原，建立斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)检测猪流行性腹泻(PED)抗体。采用此方法分别对来自加拿大、台湾省进口的种猪和海南省、广东省种猪群的血清样共834份进行了检测，检测的抗体阳性率达21。用琼扩试验与Dot-ELISA比较，阴性血清样品检测符合率为100，而阳性血清样品检测符合率为31.8，说明后者更敏感，且该试验重复性较好。于强等用PEDV吉株猪胎肠单层细胞培养物，以冻融法制备抗原，建立了间接ELISA法检测PED抗体的方法。KimO等建立了单克隆抗体基础上的免疫组化法，该方法可在福尔马林固定、石蜡包埋的肠组织中准确而特异的检出PEDV，可用于鉴别诊断TGEV与PEDV。

　　3．2．5RT-PCR法Ishikawa等根据S基因序列设计了一对可扩增目的片段854bp的引物，成功的建立了诊断PEDV的RT-PCR法，可进行细胞毒和粪便毒的检测，灵敏度可达100TCID50mL，并可在8h内测出。Kubota等[12]根据N基因序列设计了一对可扩增目的片段540bp的引物，成功地建立了诊断PEDV的RT-PCR法，可进行细胞毒和粪便毒的检测。在韩国KimO等已建立了TGEV和PEDV的二联RT-PCR诊断方法，可同时检测出10TCID50mL的TGEV和PEDV。KimO等对免疫组化、原位杂交、RT-PCR3种方法进行了比较，认为RT-PCR法检测结果的重复性最好。此外，KimO等]还建立了鉴别TGEV和PEDV的多重巢式RT-PCR法。国内乔宪凤等以PEDV的膜蛋白(M)的RNA为模板，根据Durate等人发表的基因序列，设计3条位于PEDV膜蛋白(M)基因上的引物，进行RT-PCR反应，确立了RT-PCR最适反应条件。

　　鉴别诊断

　　猪传染性胃肠炎及流行性腹泻皆属于病毒性腹泻病，诊断时要注重与一般条件因素引起的腹泻，饲料因素引起的腹泻，以腹泻为主要症状的传染病，伴有腹泻症状但以其他临床症状为主的疾病进行鉴别诊断。

　　防治

　　哈尔滨兽医研究所的科研人员研制出猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻氢氧化铝灭活二联苗，此苗在母猪产前20-30d接种4ml，仔猪断奶后10-15d接种一次，免疫效果比较好。此外，刘万钧等在实验室证实了猪白细胞干扰素在Vero细胞培养中和乳猪空肠结扎肠段中对PEDV有明显的干扰作用，还用干扰素对断奶仔猪进行PED防治试验取得了良好结果。对猪病毒性腹泻症无特效治疗方法，但为了防止继发感染和脱水造成衰竭，降低死亡率和促进康复，可以采取一些对症疗法。

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