关键词：性别决定基因；胚胎性别鉴定；聚合酶链式反应
中图分类号：Ｓ８１４．７文格标识吗：Ａ文章编号：０２５８一7033（2002）04-0048-03
许多畜牧兽医工作者一直在为实现动物性别的人为控制进行着不懈的努力。动物性别控制主要采用两条途径，即Ｘ精子与Ｙ精子的分离和胚胎性别的鉴定。在前者尚未取得完全成功的情况下。胚胎的性别鉴定成为性别控制的主要途径。家畜胚胎的性别鉴定技术是家畜胚胎移植技术的一项重要内容，是新的更高的目标之一。通过移植已知性别的胚胎，控制家畜后代的性别比例，能加快优良母畜的繁殖速度，促进高效畜牧业的发展。在养牛业上，结合胚胎分割，胚胎冷冻等动物繁殖技术，帮助选育优良母牛和增加牛奶产量。近年来，随着转基因家畜的研究进展，人们也希望能按照家畜性别比例的要求，有选择的进行所需性别的转基因家畜的研究和开发。早期胚胎的性别鉴定，使得人们的愿望得以实现。另外，在体外受精和胚胎操作技术日趋完善的今天，也迫切需要建立能与胚胎产业化相配套的性别鉴定技术。
1.动物性别决定的分子机理
1.1动物的性别决定基因——ＳＲＹ基因自古以来个体性别决定的机理一直是胚胎学的重大研究课题之一，随着分子生物学和发育生物学及其它相关学科的发展，人们从本质上对性别决定有了一些较为清楚的认识。Ｓｉｎｃｈａｒ等（1990）发现在哺乳动物Ｙ染色体上存在性别决定区（Sex determining region of Y）[1]，即ＳＲＹ基因。当将携带ＳＲＹ基因的一段基因组片段作为转基因导入ＸＸ小鼠胚胎，实现了由雌性向雄性的性反转，证明了ＳＲＹ基因为哺乳动物的性别主宰基因[2]。人们深入的研究了ＳＲＹ基因的结构和功能，它位于Ｙ染色体短臂，从着丝粒到端粒与拟常染色体区相邻的３５Ｋｂ的范围内。人类的ＳＲＹ基因只有一个外显子，长８５０ｈｐ，该基因有一个多聚腺苷酸位点和两个转录起始点，其间是一个可读框，可编码204个氨基酸，其中包含可编码７９个氨基酸的保守区——ＨＭＧ盒[3]。ＳＲＹ基因的ＨＭＧ盒在哺乳动物间具有高度的同源性，如牛ＳＲＹ基因的ＨＭＧ盒和人类的同源性达８４％。
1.2动物性别决定的机理未分化的性腺中胚层处于中性，如果Ｙ染色体存在，ＳＲＹ基因将自启动转录，在胚胎睾丸组织细胞系中表达产生ＳＲＹ因子。ＳＲＹ因子主要产生三方面的作用：一是激活下游的苗勒氏体抑制物基因ＭＩＳ（副中肾抑制基因）表达，从而抑制苗勒氏管的发育；二是抑制或对抗DSS（逆性别剂量敏感基因）基因产物，进而抑制卵巢发育；三是作用于间质细胞，使之分泌睾酮，使胎儿雄性化，导致阴茎、阴囊和其他雄性器官的形成。对于雌性动物，由于ＳＲＹ基因的缺少，使得Ｘ染色体短臂上ＤＳＳ位点基因转录，促进卵巢发育，而卵巢产生的雌激素使苗勒氏管发育成输卵管、子宫、子宫颈、阴道等。
ＳＲＹ基因仅仅是涉及性别决定过程的基因之一，近年来又发现和克隆了许多可能参与性腺分化和发育的基因，如Ｙ染色体上锌指结构基因（Ｚｉｎｃ－finger-Ygene,ZFY）是继ＳＲＹ之后又一和性分化有关的单拷贝基因，并与精子的发生有关，在Ｘ染色体上存在其同源序列ZFX[4]。另外还有上面提到的ＭＩＳ。ＤＳＳ基因以及ＳＲＹ基因的相关基因ＳＯＸ基因家族等。
2.家畜早期胚胎的性别鉴定
由于胚胎性别鉴定所潜在的巨大的经济效益以及其重大的意义，所以各国研究人员在该领域进行了深入的研究，目前已发展了许多胚胎性别鉴定的方法。
2.1细胞生物学方法（染色体核形分析）主要是利用Ｘ、Ｙ染色体在形态上的差异，通过判定胚胎细胞性染色体是Ｘ还是Ｙ来鉴定胚胎的性别。该方法缺点或存在的困难是分析性染色体需要用分裂中期的细胞，而从桑葚期和囊胚期的胚胎里取出较多的分裂球才能获得处于分裂中期的细胞，这要降低胚胎性别鉴定后移植妊娠率。
2.2免疫学方法 在８一细胞期至早期胚泡期，哺乳动物的雄性胚胎表达一种雌性胚胎所没有的细胞表面因子，即Ｈ-Ｙ抗原，利用Ｈ-Ｙ抗原和抗体免疫反应的原理可以进行胚胎的性别鉴定。
2.2.1胚胎的细胞毒性分析[5,6] 在补体（如豚鼠血清）存在的情况下，Ｈ－Ｙ抗体可以与ＨＹ+胚胎（雄性胚胎）结合，并使其中的一个或更多的卵裂球溶解，或使卵裂球呈现不规则的体积和形状，阻滞胚胎发育，受影响的胚胎即为雄性胚胎，将经培养后发育正常的雌性胚胎进行移植就可使母畜只生雌性后代。但这种方法是以破坏雄性胚胎为代价，而且其准确率不高，经这种方法鉴定的Ｈ-Ｙ+鼠胚胎移植后所生仔鼠只有８５％为雌性，这种方法很少被使用。
2.2.2间接免疫荧光分析法[5,6]以Ｈ-Ｙ抗体为一抗，用FTTC标记的Ｙ球蛋白（如山羊抗鼠Ｙ球蛋白）作为二抗，将上述两种抗体依次与胚胎共同培养，雄性胚胎上的Ｈ-Ｙ抗原先与一抗结合，一抗再与二抗结合，然后通过洗涤将未结合到胚胎上的二抗洗去，由于二抗用FTTC标记，故在荧光显微镜下显荧光，雄性胚胎显荧光，不显荧光者为雌性胚胎。这是一种非损害性胚胎性别鉴定法，鉴定过的胚胎都可以存活。但准确率不高，牛83％、绵羊为83％、猪为81％。
2.2.3 囊胚形成抑制法利用Ｈ-Ｙ抗体能够可逆性抑制囊胚形成的原理，将Ｈ-Ｙ抗血清与桑葚胚共培养，一段时间后雄性胚胎由于具有Ｈ-Ｙ抗原被Ｈ-Ｙ抗体所抑制，不能形成囊胚，而无Ｈ-Ｙ抗原的雌性胚胎则不受影响继续发育成囊胚，因此可以将雌、雄胚胎分开。然后可洗去Ｈ－Ｙ抗体，雄性胚继续发育。这种方法鉴定的胚胎存活率与正常无异，其正确率为８０％左右。但只能检测桑套期前的胚胎，如果胚胎已发育至囊胚，则无法鉴定。
2.3测定卵裂球Ｘ_染色体连锁基因剂量鉴别胚胎性别[7]从胚胎中取出一个卵裂球，采用双重微量测定法，测定其与Ｘ_连锁的次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶（ＨＰＲT）和与常染色体连锁的腺嘌呤磷酸核糖基转移酶（ＡＰＲＴ）的活性。由于在８一细胞阶段，雌性胚胎中的两条Ｘ染色体均有活性，因此可根据ＨＰＲT活性在基因剂量上的两倍差异，得到ＨＰＲT与ＡＰＲT比率的双态分布图，因而鉴别出雄性和雌性胚胎，该方法比较繁琐，所需时间长。
3分子生物学方法
3.1ｙ-染色体特异性ＤＮＡ探针利用Ｙ-染色体特异的ＤＮＡ探针与Ｙ-染色体的ＤＮＡ进行特异性结合，以鉴定胚胎性别的一种方法。早在１９８８年，ＥｉｌｉＳ等就将牛的Ｙ-染色体ＤＮＡ重复序列探针用于牛胚胎的性别鉴定。用于检测的方法有两种：一种是原位杂交；另一种是用探针与ＤＮＡ提取物相结合。这种方法的准确率超过９５％。但是这些特定序列通常具有种间特异性，所以对每种动物都必需研制不同的探针。另外，原位杂交有时还需使用放射性物质，这种方法没有被推广。
3.2聚合酶链式反应（ＰＣＲ）应用于胚胎性别鉴定ＨｅｒＴ等（1990）首先成功建立了家畜胚胎性别鉴定的ＰＣＲ法[8]。ＰＣＲ法因其特异性强、灵敏度高、快速、简便、经济等优点，在家畜早期胚胎的性别鉴定中占有越来越重要的位置，其实质就是Y-染色体特异性片段或Y-染色体上的性别决定基因的检测技术。即通过合成ＳＲＹ基因或其他Y-染色体上特异性片段的部分序列作为引物，在一定条件下进行ＰＣＲ扩增反应，能扩增出目标片段的胚胎即为雄性胚胎，否则即为雌性胚胎。由于ＰＣＲ极为灵敏，所以只要从胚胎中取出几个细胞就可以进行性别鉴定，这对性别鉴定后胚胎移植的妊娠率没有影响。龚荣慈，等实验表明，只要8ｐｇ的ＤＮＡ即可检出ＺＦＹ、ZFX序列而判定胚胎的雌雄[12]。在国内，曾溢滔，等（１９９１）就通过对牛ＳＲＹ基因的直接测序，设计引物用ＰＣＲ扩增ＳＲＹ基因来检测奶牛胚胎的性别[9]，杨建明，等[10]（１９９５）、欧阳红尘[11]（１９９５）等则通过扩增牛Ｙ染色体特异ＤＮＡ序列来鉴定牛早期胚胎性别，而龚荣慈，等设计了特异于牛ＺＦＹ基因的引物对奶牛基因组ＤＮＡ进行ＮestPCR来进行性别鉴定。黄淑帧，等通过扩增ＳＲＹ基因对转基因试管牛和试管羊胚胎进行了性别鉴定，得到的转基因牛和转基因羊的性别和鉴定结果完全一致[13]
用ＰＣＲ鉴定家畜胚胎的性别其主要程序为：①胚胎的获取：冷冻胚胎、刚从供体牛回收的鲜胚或体外受精培养的胚胎都可以用来鉴定性别；②引物的设计：根据Ｙ染色体上的性别决定基因或特异性片段设计引物，同时设计一对公母共有基因引物作为内对照，避免假阳性的发生；③用显微操作或徒手从胚胎中取出几个细胞热处理后进行ＰＣＲ扩增；④电泳检测。能同时扩增出Y-染色体上相应片段和公母共有基因片段的胚胎即为雄性胚胎，而只能扩增出共有基因片段的胚胎即为雌性胚胎。
ＰＣＲ鉴定胚胎性别的研究成功，使胚胎的性别鉴定进入了一个崭新的发展阶段，但是只有进一步研究简易快速的胚胎切割取样技术、胚胎性别鉴定的ＰＣＲ试剂盒以及取样胚胎的冷冻保存技术，才能达到推广应用阶段，相信在不久的将来，所有这些问题都能得到解决。
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