在未来的养猪" style="FONT-SIZE: 14px" href="http://cj.zhue.com.cn/jinrijujiao/" target="_blank">养猪生产研完中,营养学和分子遗传学结合的方法将显示出很好的应用前景。鉴定影响猪营养利用、生长性能和排泄成分相关基因的遗传变异;为猪生产技术的进一步提高提供了一个极好的突破点,有助于优化猪的营养撮入和环保型生产方式的实施,从而有利于养猪业的可持续发展。
养猪生产的效率(表型)受遗传因素和环境因素的影响(表型;遗传X环境)。显著影响猪生产性能的环境因素关系到动物的健康、福利和营养状况。
环境因素的变化可以通过分子水平上基因的表达和该基因所编码蛋白质的变化表现出来。这些变化将导致一系列动物繁殖、组织发育和生长的生理信号产生。 半个世纪以来,通过生物化学、遗传学以及比较生物学方法,一些十分重要的基因产物在实验中得到了验证和充分解析。在医疗诊断手段市场化的过程中,这些生物大分子开始逐渐确立其起主要作用的地位,并开始展现其作为重要工具,在动物生产和育种中具有广阔的应用前景。
人类基因组计划的完成以及正在进行的家畜基因组测序工作,为发现影响养猪生产的重要相关基因提供了一个研究平台,并且大大加快了其发现这些基因的速度。
遗传调控体系控制营养物质的消化、吸收和代谢,同时控制营养物质在体内的分配,机体生物合成和排泄物的产生。我们运用“营养组学”这个新词米涵盖与代谢过程直接相关的动物基因组部分。 营养组学的研究直接影响养猪业的生产效益及其所产生的环境压力。然而,很少有投资是直接用于研究涉及动物营养和排泄的遗传优化方面的。
动物饲料宁没有被消化和没有被吸收的蛋白质对于生产者来说是一种经济损失。而且会被厌氧菌降解产生有毒和有恶臭的气体成分。比如过多的色氨酸被转化为苯酚和磷-甲酚;过量的酪氨酸降解为吲哚和粪臭素;过量的甲硫氨酸和半胱氨酸会转化为硫化物等(Gottschalkl986:Mackieetal-1998)。
这些排泄物气体中的挥发性有机化合物,伴随氨气,硫化氢和其他成分不确定的气体排放到大气中,已经引起了有关部门对封闭管理猪场" style="FONT-SIZE: 14px" href="http://js.zhue.com.cn/yangzhujishu/zhudehuanjing/200808/26-42385.html" target="_blank">猪场附近社区居民生活环境的关注。随着城市范围的持续扩展,围绕猪场排泄物所引发的问题可能变得愈来愈严重。
虽然没有什么证据证明粪便的恶臭对人的健康有害,但是一些粪便和粪便气体中的成分确实对环境有潜在的危害,同时降低了封闭饲养猪场" style="FONT-SIZE: 14px" href="http://js.zhue.com.cn/zhuchangjianshe/200807/17-38843.html" target="_blank">养猪场周围社会区居民的生活质量。氨气不仅是对呼吸有害的刺激物,而且会增加土壤的pH值,使附近湖泊、江河和溪流富营养化。
同样地,硫化氢,一种有臭鸡蛋味的气体,高浓度时可能导致窒息的化学物质。粪便渗漏的结果是磷和硝酸盐转移到土壤和地下水中,同时提供了病原体入侵的潜在渠道。这个入侵渠道的产生可能选择了对抗生素具有抗性的病原体,这是由一个依赖抗菌素亚临床剂量产品作为发展动力的工业带来的特别麻烦(Cromwell,2002)。
1998年12月,欧洲当局已经禁止使用有抗菌素的饲料添加剂。相应地,美国也可能跟随其后出台相关法规。因此,市场和立法强制要求养猪业的发展能在不使用抗菌素的情况下具有最佳饲料转化率,降低排泄物产生和有害气体的释放。
1 猪的代谢
来自同一物种的两个个体的DNA序列是高度相似的一家养猪种大约900个核苷酸中只有一个核苷酸的差异(Fahrenkrugetal,2002)。DNA的差异(多态性) 包括单核苷酸多态性(SNP),插入/缺失或DNA重复长度的差异。
至今为止,由于事实上这些核苷酸的差别不在基因内,它们多数对动物生产性能没有影响。而存在于基因内的一些多态性,仅对其编码的蛋白质有细微影响。这样的差别可能只有与其他位点多态性互作的时候才能显示出来。只在极少的情况下DNA多态性才对表型产生显著效应,例如疾病。
目前先天性代谢障碍研究协会列出的人类代谢遗传病超过100种。虽然经过几个世纪的选择培育,遗传多样性影响家畜代谢的可能性仍然存在,在家畜群体中出现的先天性代谢障碍(1EM)清楚地表明了这点。
例如,Ossabaw猪是由西班牙人船运到乔治亚岛的,经过500年的自然选择,那些存留下来的猪适应了食物时多时少、并且只有橡树籽和咸水作为食物的生存环境。这种猪与美国印第安比马人一样对11型或者非依赖胰岛素糖尿病易感(马克思,2002)。
由于大多数代谢变异不会导致疾病,所以极少被发现。例如,有些奶牛所产的奶有鱼腥味,这是由于牛奶中三甲胺的水平过高引起的,而这种三甲胺的水平升高是因为黄素单加氧酶—3基因发生了一个突变。 由于没有明显的外部表型变化,所以这种先天性代谢障碍病直到最近才被发现,而且生产实践采用的牛奶集中收集方式也完全掩盖了这种遗传变异,以致这种有害突变在一些牛种中保持着较高的频率。
以上例子是遗传多样性对动物代谢的重要影响的明显证据。对已发现和很多还未被发现的遗传变异来说,发展分子标记和诊断工具就使家畜代谢潜能达到最优成为可能。
2 营养目标的优化
饲料转化率直接影响畜牧业的效益,而畜牧场产生的废物及其所含一些的化学物质又间接地影响了环境。目前大部分提高猪饲料转化率的方法都集中在控制采食方面,虽然饲料转化率明显受遗传影响,但是这种严格的控制采食的方法却是以所有的猪有相同的遗传性能为前提的。
在生产群中对猪遗传性能高低的划分正是用大量与饲料转化率相关的性状来评估的,包括平均日增重、日采食量、饲料转化率以及整个生长期的饲料转化率(Bereskin,1986;Clutter和Brascamp,1998;Hermeschetal.,2000),因为饲料转化率性状与胴体性状,例如后腿重量、臀肌重量和平均背膘厚度之间有相关性(Bereskin,1986:C1utterandBrascamp,1998;Hermeschetal,2000)。
尽管这种以高遗传性能个体的选择为手段的方法为遗传改进提供了很好而合理的原理,然而传统方法却要求有一个合适的饲养程序,这个程序是基于准确监控个体饲料摄入量和生长过程中生长性能而设立的。标记辅助选择(MAS)方法能为这些特性的优化提供一种更有效且低成本高回报的方法,这种方法只需要提供试验资源群体的表型资料即可。
通过采食控制来降低猪场废气排放的尝试也遇到令人困惑的结果。饲粮中非淀粉类多聚糖影响尿和粪便中氮含量的比例、氨气的散发、尿及粪便等排泄物的pH值(Cahnetal.1997,1998a-b;Mrozetal.2000).
通过在饲粮中添加脂肪酸以降低尿的pH值,同样发现可以降低从尿和粪便中散发的氨气(VanKempen2001)。 用氨基酸代昔饲粮中的粗蛋白质的方法已经显示可以相当成功地降低来自猪排泄物中氨气的发散,某些情况下,也可降低挥发性脂肪酸的产生(Suttonctal.1999;Hayesetal.2004;Ottoetal.2003)。ObrockHegel(1997)发现通过控制饲粮氨基酸水千方式所饲养的动物的排泄物,其散发的气体中吲哚、粪臭素和磷甲酚水平较低。
营养组学显然能用影响排泄物成分的方式对饲粮处理做出反应,但是这些目前在猪群中出现分离的生产性状真的有其相应的遗传潜能吗?遗传改进方面还有什么工作可以做呢?
到目前为止,很少有研究去检测与猪排泄的产生,及其化学组成有关的遗传因子。Crocker和Robison(2002)的一项研究测定了几组动物,评估与猪排泄量和排泄物成分有关的遗传因子,这是我所知唯一一个这方面的尝试。他们的研究已经显示白色猪种(大白×长白)和杜洛克×汉昔夏杂交猪在排泄物的量和成分上均存在明显的差异。
另外,具不同睾丸甾酮水平的两个杜洛克家系之间排泄物的成分也存在明显的差异(克罗克和罗比森,2002)。相对于杜洛克×汉昔夏杂交猪,大白x长白杂交猪排泄物中所有被检测的营养成分和化学成分量都较少,而且排泄物中钙、铜、锌和铁含量明显较少。在杜洛克品种中,高睾丸甾酮水平选择系,除了氨氮和铁以外,磷、钙、铜的排泄量也很大。
猪排泄物的成分不仅是一种营养摄入和遗传的产物,也是存在于猪胃肠道的细菌的活动产物。在猪肠道里的细菌群非常复杂存在几百种细菌和无数变异株(Gaskinsetal.2002)。大量证据表明猪胃肠道的微生物群自身也受营养和遗传因素的影响。
例如,细菌与寄主的相互作用可明显的受遗传编码的抗原决定基的变异影响。Gaskinsetal.(2002)解释:“在小肠近端,食糜的蠕动引起细菌冲失的速度,超过细菌典型地繁殖形成菌落的最大生长速率,相应地,在小肠的这一区域那些黏附在粘液层或上皮细胞表层的细菌通常就占优势地位了。
很多刊物都提到了肠上皮细胞细菌与特殊复合糖原(受体)的相互作用(Bocketal.,1988)。其中一个研究得最多的是在猪胃肠道内EscherichiacoliK88(F4)和它受体的相互作用。该受体有三个等位基因,这个受体结合E.coli这类菌株,允许它在小肠内繁殖,引起新生仔猪和断奶的小猪的腹泻,受体上有特殊等位基因的猪不受E.coli的影响。
虽然许多研究已经对K88受体基因进行基因定位及精细定位,但受体的特性和基因仍未确定(Jorgensen et a1.2003)。 有另一个E.coli.菌株0139:K12(B):H1:F18ab血清型的猪结合受体(Vogelietal.,1996).研究认为该受体是可通过上皮细胞结合芯片检测,并被定位在猪六号染色体上。对应的基因已经确定为alpha-(1,2)-fucosyltransferase 1gene(FUTl) (MeUerinketal.,2000)。有趣的是,这个基因的产物并不是细菌的受体,而是调控受体fucoslyation状态的酶。
许多例证揭示了影响猪胃肠道部位大肠杆菌分布情况的宿主基因确实存在。而细菌在影响猪排泄物成分中所起的特定作用,不但引入了宿主基因组通过控制菌群分布情况而影响排泄物成分的间接作用的概念,而且论证了分析猪基因组与微生物基因组之间关系的必要性。
3 分子遗传学研究
就许多与家畜营养密切相关的性状来讲,对大量核心群或者生产群进行表型测量是受到成本限制的。标记辅助选择可通过鉴定和繁殖具有高生产性能的种质为育种者提供了一个强有力的手段。(Dekkers和Hospital,2002)应用这种技术我们可以通过分子诊断来做选育的决策,这种分子诊断技术可以揭示出遗传上优良的等位基因是否传递到了下一代。有关动物遗传的研究资料也使这种符合动物代谢潜能的生产实践得到进一步发展。
为了实施标记辅助选择计划,我们就要先鉴定出那些导致生产性能出现预期分离的遗传座位。这些遗传座位可用家畜生产性能和遗传标记之间的相关分析来定位。“基因组扫描”是一种当前用于发现引起动物生产性能发生可遗传变异的方法,这种方法还可将这些发生变异的座位定位在动物基因组的特定位置。 基因扫描这种方法的目的是发现那些在有一定结构的家系中伴随所研究生产性状的变异,出现分离频率最高的基因片段(Kruglyak 和 Lander,1995a,b;darvasi,]998)。这种方法涉及基因片段的分子追踪、性状的系统测量和用于计算连锁率的强大统计工具的使用。
这种可以使相关基因在染色体上的位置得到定位并最终鉴定出影响表型的基因,用这种方法发现变异基因并对变异的基因作图的准确性取决于性状的遗传力、涉及的基因数目、表型变异的程度和群体的大小。
表型和基因型判定的准确性至关重要,借助一个足够大规模的群体和具有高密度分子标记的遗传图谱,基因扫描的方法可以将一些影响生产性状的重要基因定位在染色体的10-50CM(Daetal.,2000),更精细的遗传图谱(在已发现的位点周围增加标记密度)可以将一些候选位点进一步定位在只包含几百个基因的染色体片段区域。
家畜基因组测序工作将逐步提高对重要染色体片段及其所包含基因的基因定位效率和准确性。
许多研究试图定位与猪繁殖性状相关的位点(Rathje etal.,1997;Rotheretal.,2001:Braunschweigetal.,2001),以及与生长和胴体组成相关的位点(Andedsoneta1.,1994;wangetal.,1998;rohrerandkeele,1998a-b;marklund et al..1999;paszeketa1.,1999;DeKoningetal.,1999:Perezencisoetal.,2000:rotheretal.,2000;maleketa1,2001a)。 与肉质相关的位点的基因定位研究开始了少量的研究(Andersson-Eklundetal,1998;Milanetal.,1998;Wangetal.,199;Moseretal.,1998;Yuetal.,1998;Dekoningetal.,2000a-b;Malek etal.,2000b;Thomsenetal.,2004;)。
以上的研究表明几乎猪的每条染色体都包含至少一个影响生长、屠宰性状或肉质性状的数量性状位点。这些研究所用的资源群体都是西方猪种与外来猪种(中国猪种或野猪)杂交的F2代群体,虽然在这些外来杂交群体中鉴定出的位点并没有重现在家养猪种中,而是在西方猪种和欧洲杂交猪种中,这些位点通常发生一定程度的分离。
这些数量性状位点主要在猪的1号染色体(SSCl),7号染色体(SSC7),X染色体(SSCX)上(RohrerandKeele,1998a-b;Maleketal.,2001a-b;Nezeretal.,2002),以上这些染色体区域也开发了分子标记,并进行QTL检测,用于研究商品猪种的生产性能和群体的多样性,在世界范围内这些染色体区域目前已经作为用于选择有利等位基因的主要目标区域。 尽管用于猪基因组扫描的猪群采用自然交配,但第一阶段的基因组扫描研究在大多数情况下都忽视了动物营养、饲料转化率和排泄废物等表型性状,值得注意的是尽管我们假定瑞典的研究中(指Andedson等1994的研究)没有使用从1986年以来被禁用的抗生素,但要确定这些研究中所饲喂饲料中抗生素的情况事实上是不可能的(Stein,2002)。
在获得胴体性能和肉质提高的同时,应该同时获得更高的饲料转化率并降低环境压力,这一点是非常有意义的。
如果没有经济和时间限制,我们主张对营养和排泄物相关性状的基因扫描应该考虑到性状遗传力和品种差异的因素。这方面的信息有助于我们设计建立一个具有最大表型变异的理想的资源群体,其中一方可能是外来品种,然而这并不是将这项技术在生产实践中应用的最优方法。
对这些与外来猪种杂交所产生数据资料的解释,既定位当前或潜在于商业猪种中某些QTL变异位点,这种研究由于杂交过程可能导致其他生产性状优秀的猪种基因的渗入而需要考虑到这是带一定风险性的工作。
使用那些已知含有一些在排泄物组成性状方面存在基因变异的品种似乎是很好的方法(Crocker和Robison,2002),事实上到目前为止,只要依*一个包含约克夏、长白和杜洛克的群体就可以解释美国大多数商品猪群体的排泄物组成情况。
为了估计营养和排泄物组成等有关性状的遗传力,并最终找到影响它们的重要基因,需要分析大量个体(500—1000)的饲料摄入量、动物生产性状和排泄物组成。尽管在电子饲喂器的使用可以监控每组个体的采食情况(Eissenetal,1999;Hyunetal.,1997,2001,2002;Bruininxetal.,1997,2001,2002;Bruininxet a1.,2001),然而事实上单圈饲喂更符合收集个体排泄物的要求。
检测粪、尿和排泄物成分的技术已经成熟,粪便组织成分中的钙、氯化钠、铜、磷、钾、镁、锰、钠、锌和铁可以用电感双等离子释放光谱来分析。粪便中的碳、氮和硫可以用氧化分解法来测定。粪便的吲哚、氨和硫化氢可以用固体微抽提法测定。 粪、尿和排泄物成分分析为研究提供了有价值的信息,但这种方法要想分别单独收集尿就要给家畜做插管手术,因此考虑到群体大小的因素,这种方法其实并不现实。
3 基因的发现及其在生产上的价值
利用现有的资料,我们可以用饲料转化率和排泄物特征等性状的表型和遗传参数进行统计分析。重要的表型参数包括表型均值、每个性状的方差、加性方差和上位方差、每个性状的狭义遗传力和广义遗传力以及饲料转化率、生产性状和排泄物性状三者之间的遗传相关。约束最大似然法可以估计用于计算遗传力和遗传相关的方差和协方差组分(Patterson和Thompson,1972)。
遗传图谱基本上有两种,连锁图谱主要通过分析家系中遗传标记位点的等位基因与可能的性状位点的等位基因之间的分离、重组关系来确定的。而连锁不平衡图谱(LD)不同于连锁作图,它研究的是家系内和家系间的遗传标记位点和有关性状等位基因之间的关系(Schorketal.,2000)。
既然连锁分析基于一个家系内基因位点与表型之间连锁和分离,那么相关分析或连锁不平衡图谱就是基于家系中基因与表型之间连锁分离情况与家系间单模型中等位基因与表型之间随机连锁分离情况的背离和偏差。一个高密度的连锁不平衡图谱可以方便的鉴定和定位可能影响单个性状和复杂性状的基因位点,这点在人医方面已经得到了有效的利用。 半参数法可以用于寻找与复杂性状连锁的基因位点,并可用于估计连锁不平衡图谱中分子标记之间的连锁程度(WuandZeng,2001;Zhaoetal.,1998)。这些方法可以在获得遗传标记连锁(通过重组片段来计算)信息的同时,获得标记之间的连锁不平衡(以同源相同性片段为特点)程度。
未来我们对猪重要经济性状位点的定位将不仅依*连锁图谱,还要依*连锁不平衡图谱。要进一步提高连锁不平衡图谱密度,就需要发现比现在更多的分子标记,而猪基因组测序将大大提高图谱的分子标记密度。
目前动物基因分型技术的主要手段是利用分布在猪基因组每隔10—1000千碱基对的简单重复序列。尽管这些简单重复序列是制作遗传图谱的工具,但这种简单重复序列并不适合用于高通量基因分型平台。另外,简单重复序列是通过重复状态来鉴别的,并不总是通过一致性鉴别的,这样就使基因型信息的分析更加复杂。
不同于简单重复序列(SSRs),单核苷酸多态性(SNPs)在基因组中含量丰富(在人基因组中每1000个碱基对就有一个杂合位点出现)(Chakravarti,1999),并且这种标记适合高通量的基因分型平台。另外,单核苷酸多态标记极其稳定,在人基因组中2 × 108个核甘酸中仅有一个突变(Sachidanandametal.,2001)。 由于回复突变率很低,所以用重复状态来鉴别的SNPs几乎完全可以代表用一致性鉴别的SNPs。因此以SNP为基础的分子标记系统是进行家畜遗传特征和遗传组成分析的理想工具。连锁不平衡分析的效率受到每个标记内等位基因数目、频率及标记密度的限制(kruglyak,1997),在大多数情况下,每个SNP仅有两个等位基因,它们在基因组中以很高的频率出现;相邻的一组SNP等位基因可以表现出连锁不平衡模式的特征,正是如此,这一组SNP产生出的单倍型多样性可以用于直接连锁分析和直接相关分析(Nickersonetal.,1992)。
现在已经出现越来越先进的算法用于分析性状与特定单倍型频率之间的相关(Fallinetal.,2001),另外, 因为SNP基因分型提供了可以了解可遗传给后代的染色体的遗传机制,所以基因组扫描可以延伸到其他相关性较小的家系,这样可以提高检测能力,同时发现那些适合制作精细图谱的群体和个体动物,而这种精细图谱制作的目的正是鉴别影响重要经济性状基因。
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