| 核心提示：饲料特别是植物性饲料中含量较多的非蛋白氮化合物如氨化物不能或不能完全被单胃动物(如猪、禽等)利用，只有真蛋白质才能被单胃动物消化、吸收与利用。因此饲料真蛋白质含量比饲料粗蛋白含量更能反映出饲料的营养价值。 |
一、原理
蛋白质在一定碱性条件下能与重金属盐类发生盐析作用而析出沉淀．此沉淀物不溶于热水。而非蛋白氮类物质易溶于水。用热水洗涤沉淀．将水溶性含氮物质洗去，剩下的沉淀物质再用凯氏定氮法测定即可得出饲料真蛋白质的含量。
二、测定所需的材料
1．仪器和设备
实验室用台式粉碎机、分样筛(20目)、分析天平(感量0．1mg)、烧杯(250m1)、玻璃棒、玻璃漏斗、中速定量滤纸(直径15cm)、表面皿(直径10cm)、干燥箱(可控温度65～70℃)、凯氏烧瓶(100m1)、烧煮炉或电炉、半微量定氮蒸馏器、容量瓶(100m1)、锥形瓶(250m1)、酸式滴定管(50m1)。
2．试剂与试液
硫酸AR、10％ 硫酸铜水溶液、硫酸钾或无水硫酸钠AR、氢氧化钠AR、40％ 氢氧化钠水溶液、2．5％氢氧化钠水溶液、2％ 硼酸水溶液、0．05％mo]／]盐酸标准溶液、氯化钡试液、5％氯化钡水溶液、0．1％ 甲基红乙醇溶液、0．5％ 溴甲酚绿乙醇溶液。
三、样品的选取与制备
取有代表性的样品约lkg。用四分法分为两份。一份装瓶加封作为留用样品。另一份粉碎过20目。装于广口瓶中贴标签待测。
四、测定步骤
1．试样的前处理
准确称取试样1～2g(精确到0．1mg)于250ml烧杯中，加蒸馏水50ml煮沸．依次加入10％硫酸铜水溶液20ml和25％氢氧化钠溶液20rnl，边加边搅拌，加完后继续搅拌几分钟。放置2小时或静置过夜，沉淀物以中速定量滤纸过滤。用70℃以上热水18ml反复洗涤沉淀．直至滤液无沉淀为止(取氯化钡试液滴于表面皿中。加2mol／l盐酸溶液1滴．滴人滤液．在黑色背景下观察应无白色沉淀)。然后，将滤纸和沉淀物包好，放人烘箱中在65～70℃下干燥2小时。
2．试样的消化
将烘干的试样连同滤纸一起放人凯氏烧瓶中．依次加入硫酸钾或无水硫酸钠9 硫酸铜1 浓硫酸25ml，摇匀，尔后置于电炉上先低温(100～200~C)加热，注意防止泡沫浮起，待泡沫消失后再提高加热温度(约410~C)至沸腾，消化至溶液澄清无黑点并呈蓝绿色，再继续加热30分钟，然后将凯氏烧瓶移出电炉放冷。
3．定容
将冷却后的消化液加蒸馏水约10～20ml，’摇匀后转入100ml容量瓶中，再加10～20ml蒸馏水洗涤凯氏烧瓶。溶液并入容量瓶中，如此反复洗涤，直至消化液全部转入容量瓶中。待冷却至室温后，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀。即为试样分解液。
4．蒸馏
采用半微量凯氏定氮蒸馏法。先将水蒸汽发生器与半微量凯氏定氮蒸馏器连接好。在水蒸汽发生器的水中加入甲基红指示剂3滴与硫酸数滴，使水溶液保持橙红色，否则应补加少许硫酸。取20ml2％硼酸水溶液于250ml锥形瓶中，加0．1％甲基红乙醇溶液5～6滴，0．5％溴甲酚绿乙醇溶液2～3滴，摇匀。然后将锥形瓶置于半微量凯氏定氮蒸馏器的末端．使冷凝管末端浸入此吸收液面下2／3处。准确移取试样分解液10～15ml注入半微量定氮蒸馏器中，用少量蒸馏水冲洗进样口，尔后缓慢加入40％氢氧化钠水溶液20ml。用少量蒸馏水冲洗进样口，用玻璃塞塞好进样口。再加适量蒸馏水封住进样口以防止漏气。蒸馏3～5分钟以后待冷凝管末端管口之馏出液呈中性(红色石蕊试纸不变色)时将冷凝管末端离开吸收液面并冲洗冷凝管末端管口，洗液并入吸收液。再蒸馏1～2分钟后用蒸馏水冲洗冷凝管末端管口，洗液并入吸收液。然后将锥形瓶移出，准备滴定。此时应夹断气源。排出废液，准备下一个样品的测定。
5．滴定
吸收氨后的吸收液立即用0．05tool／1的盐酸标准溶液滴定使溶液颜色由蓝绿色变为灰红色即为滴定终点。同时记录盐酸标准溶液的耗用量。
6．空白
在进行样品测定的同时进行空白测定。空白测定除不加试样外其他操作步骤与试样相同。空白试验消耗的盐酸标准溶液的体积不得超过0．5ml。
7．结果计算
五、注意事项
1．在试样的前处理过程中，“煮沸”要求是加热至沸并保持30分钟，目的是使试样中的非蛋白氮类物质充分溶解于水中。加10％硫酸铜溶液和25％氢氧化钠溶液时最好采用移液管移取，然后沿着烧杯内壁缓慢滴加，一方面防止局部氢氧化钠太浓将溶解部分蛋白质，这样会导致最终结果偏低；另一方面是为了使试样中的真蛋白质充分盐析：放置2小时或静置过夜也是这个道理。沉淀物宜以双层中速定量滤纸过滤，双层滤纸可以加快过滤速度，同时又不致于将沉淀物过滤掉。滤液无SO+2表明了已充分洗涤沉淀物，因为如果滤液中仍有SO+2 。则表明沉淀物中间仍可能夹杂有部分可溶性非蛋白氮类物质(如NH )，若不继续洗涤则将导致最终结果偏高。将滤纸和残渣(沉淀物)包好放入烘箱中于65～70cc下干燥2小时是为了使沉淀物充分干燥。一方面是为了避免沉淀物中仍夹杂有一些氨类物质(尽管这种情况一般不会发生。因为滤液已经过了氯化钡试液的检验，但仍不能排除因人眼观察的局限性使其中间仍夹杂有部分热烘干的过程中挥发掉)；另一方面也是为了下一步试样消化的顺利进行。因为如果试样潮湿，炭化升温过快，气体骤然膨胀不易从凯氏烧瓶中散发出去，很容易使试样与气体一同冲出凯氏烧瓶从而导致消化失败。
2．消化时应经常转动凯氏烧瓶以便使消化进行得迅速而完全。在炭化时如有黑色碳粒溅在瓶壁上应将凯氏烧瓶移出。待冷却后加少量蒸馏水冲洗之。尔后再继续消化
3．对胶体物质或脂肪含量较高的样品。消化时应防止泡沫溢出瓶口．如发现有泡沫溢至瓶颈时应立即移开火源，并加1～2滴蒸馏水再继续消化。
4．蒸馏过程中要注意气体通路。即管夹要有一个打开，以免烫伤。在加试样分解液或碱液于反应室时要快。应先检查气源是否夹断。废液流出口是否畅通。开始蒸馏时应先通蒸汽后夹断废液排出口。否则所加液回流排出。
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