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猪乙型脑炎病毒的防治技术

作者:佚名来源:互联网时间:2014-11-13 20:29点击:

  

  日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV),又称乙型脑炎病毒,简称乙脑病毒,属于黄病毒科(Flaviridae)黄病毒属。由JEV引起的脑炎(简称乙脑)是严重威胁人畜健康的一种中枢神经系统的急性传染病。由蚊作为传播媒介,以高热、狂暴或沉郁等神经症状为特征。具有明显的季节性和一定的地理分布区,多发于夏秋蚊类大量孳生的季节。JEV基因组为正链RNA,长约11 kb,包括3个结构蛋白基因,7个非结构蛋白基因和2个非翻译区。由JEV引起的流行性乙型脑炎主要在东亚的一些国家和地区流行,我国是流行性乙型脑炎的高发区,亚洲每年乙脑病例有5万多人,其中约有万人被致死,因此流行性乙型脑炎是亚洲公共卫生的重要问题之一[1]。流行性乙型脑炎属于自然疫源性疾病,猪是主要中间宿主和扩散宿主,也是主要的传染源。许多研究表明,猪流行性乙型脑炎与人流行性乙型脑炎密切相关,因此预防猪感染本病是防止人患乙脑的重要措施。同时,乙脑也是猪的重大疫病之一,能引起怀孕母猪流产、死胎及弱仔,公猪睾丸炎,仔猪呈神经症状,其暴发常给养猪业带来巨大的经济损失。

  JEV的分子生物学特性

  1.1 JEV的基因组特性

  JEV基因组为单分子线状正股单链RNA,球形,有囊膜,直径约为40 nm,GC含量为47%~49%,其基因组长度约为11 kb,其中5′端有Ⅰ型帽状结构,3′端无 poly A尾[2]。病毒基因组仅含有一个开放阅读框(open reading frame,ORF),编码产物通过裂解和加工形成约10个蛋白,由5′端末端编码,而3′端编码非结构蛋白(nonstructural protein,NS)。包括3个结构蛋白基因:核衣壳蛋白(C)、膜蛋白(prM)、囊膜糖蛋白(E),7个非结构蛋白基因(NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B和NS5)和2个非翻译区。根据核苷酸和部分氨基酸序列确定的基因组顺序为5′-C-PrM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3′[3]。

  对RNA病毒而言,一般认为帽状结构可增加RNA的感染性,这可能与其可提高翻译效率、增加RNA的稳定性和防止宿主细胞对RNA的降解有关。5′端帽状结构对多数病毒RNA的稳定性和感染性具有重要作用,而对另一些病毒的RNA则非必需[4]。黄庆生等[5]研究表明,裸露的乙脑病毒RNA是否有5′mGpppA对其感染性和稳定性没有任何影响。而天然的乙脑病毒RNA都带有帽状结构,有待于进一步探讨这一结构对该病毒的转录与翻译起何作用?

  1.2 JEV的结构蛋白和非结构蛋白特性

  JEV有3种结构蛋白:核衣壳蛋白(C)、膜蛋白(prM/M)、囊膜糖蛋白(E);7个非结构蛋白(NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B和NS5)。

  C蛋白由 136个氨基酸组成,相对分子质量 13 ku,位于第 1个 AUC起始的单一 ORF的 N末端。首先由氨肽酶切除大分子前体蛋白第 1个甲硫氨酸残基 (Met)形成 C蛋白,在合成部位由 C端疏水性氨基酸将其暂时固定在粗面内质网上,以便装配成衣壳,用来包装基因组。富含赖氨酸 (Lys)和精氨酸 (Arg)(23%~ 25%)所带的正电荷在形成壳体时,可与基因组相互作用。C蛋白的作用是在合成部位由 C端疏水性氨基酸将其暂时固定在宿主细胞的粗面内质网膜上,以便装配成核衣壳包裹基因组,保护基因组免受核酸酶或其他因素的破坏。

  E蛋白基因大小为1 500 bp,编码500个氨基酸残基,分子质量53 ku,囊膜糖蛋白E是主要的毒力抗原,参与病毒复制的许多过程,包括结合受体、膜融合和毒粒包装等[2-3];E蛋白上有特异性抗体的中和表位,可诱导免疫动物产生中和抗体。E蛋白与病毒的毒力、宿主范围、组织嗜性、膜融合、保护性免疫、血凝反应和血清特异性有关。以往关于JEV E蛋白表位的研究中,公认E蛋白分为3个结构区[6],即Ⅰ区、Ⅱ区和Ⅲ区。Ⅱ区被认为具有中和与血凝抑制的表位,Ⅲ区具有受体结合活性。

  prM蛋白是未成熟病毒体的一部分,在病毒感染后期,它被水解为M蛋白后才发育为成熟的病毒体[3,6],它可以诱导保护性免疫。M蛋白参与病毒囊膜的构成。

  非结构蛋白有RNA依赖的RNA聚合酶NS3及NS5。NS3作为解旋酶、蛋白酶以及RNA酶复合物的一部分,裂解聚合蛋白的大部分。NS3蛋白的C末端和 N末端的氨基酸组成已研究清楚,具有亲水性基团。Takegami等认为,NS3蛋白是一个具有激酶和解旋酶特性的多功能蛋白。交叉免疫试验表明,NS3是最主要的交叉反应蛋白。NS3蛋白还具有与 RNA结合及 ATP活性。Chen等研究了JEV3′- NCR与 NS3蛋白和 NS5蛋白的相互作用,发现NS3和NS5在体内相互作用形成蛋白复合物,继而与 3′- NCR的茎环结构形成复制复合体参与负链 RNA的合成。可见,NS3蛋白在病毒感染细胞中对病毒 RNA的复制具有十分重要的功能。

  NS5蛋白是分子质量最大且是黄病毒科中最保守的蛋白[7]。与其他病毒的RNA多聚酶比较,乙脑病毒NS5蛋白存在有RNA多聚酶的一些功能基团,这些功能基团主要位于其羧基端 2/3区域[8],提示乙脑病毒NS5蛋白就是乙脑病毒的RNA多聚酶。而余福勋等[7]通过研究提示乙脑病毒NS5蛋白与乙脑病毒的致病有一定关系,并成功表达、纯化了乙脑病毒部分及全长NS5蛋白,纯化的乙脑病毒NS5蛋白在体外证实具有RNA依赖性RNA多聚酶活性。

  NS1是糖基化蛋白,为乙脑病毒的保护性抗原,而NS1蛋白为可溶性补体固定抗原。非结构蛋白NS1在感染细胞的表面表达,细胞外分泌,不仅能诱导免疫反应而且能提供保护性作用。这个保护作用依赖抗体的Fc部分, NS1专一性抗体通过补体依赖途径杀死目标细胞[9]。这为JEV核酸疫苗的研制提供了依据。

  NS2蛋白:NS2A的分子质量约为17 ku,NS2B约为13 ku,均为疏水性蛋白,在所有黄病毒中其同源性最低。NS2蛋白可能与膜功能有关。

  NS4蛋白:NS4A和 NS4B均为疏水蛋白。有关其结构与功能方面的研究未见报道。

  2 JEV毒力和致病分子机理

  对乙型脑炎病毒功能与结构的研究尤其是对影响乙脑病毒毒力的关键性位点或功能域的定位,一直是乙脑病毒的研究热点。这些研究为乙脑的新型疫苗研制提供了理论基础,但不同毒株毒力和致病机理有些差异。许多研究者对不同型JEV毒株的强毒株的基因序列进行比较,推测出减毒的关键位点或区域。乙脑病毒SA14株的致病力关键性位点是通过减毒的活疫苗株与亲代毒株的核酸序列比较推测出来的[10-13];Hasegawa H等[14]将JEV kamiyama株与其减毒株进行氨基酸序列比较,发现E364(Ser→Pro)、E367(Asp→Ile)和E52(Gln→Arg/Lys)的替代,可降低其对3周龄小鼠的毒力,且改变JEV与细胞间的早期作用;Cecilia D等[15]通过对JEV Sar两个毒力降低的变异株r27和r30氨基酸的比较发现,其中E270位点Ile变为Ser,E333位点Lys变为Asp,导致了乙型脑炎病毒毒力的改变;Vrati S等[16]报道神经侵袭力较弱G78株毒力定位到E蛋白的序列上,E76位点Thr变为Met,影响了病毒与细胞的融合。由此可见,E蛋白有着多个影响乙型脑炎病毒毒力表型的位点,我国学者范行良[17]的相关报道对此予以了证实。

  李晓宇等[18]对1949年以来在中国乙脑主要流行地区分离的19株乙脑病毒的prM-C区及E蛋白基因区的核苷酸序列进行了对比研究,以乙型脑炎病毒疫苗株P3株为标准,对各病毒E蛋白500个氨基酸序列进行分析, 结果发现其中18株病毒E蛋白活性结构域与疫苗株P3株相比共有247个氨基酸的差异,平均每株病毒有12个~35个氨基酸的差异,而且其中包含着E402重要位置的氨基酸差异。有待进一步深入研究这种差异对病毒的毒力有何影响。

  李玉华等[19]通过比较乙型脑病毒弱毒株at222与强毒AT31全基因核甘酸序列,结果发现E138位点的氨基酸为强毒JaGArol、JaoAr9982、Beijing-1与SA14所共有,而at222E138、E176位点上氨基酸决定了乙脑病毒的病原性。乔宪凤等[20]对WHe株和12株JEV强毒株与减毒活疫苗SA14-14-2氨基酸序列比较,结果发现有一个新的可能与JEV毒性密切相关的位点E447,该残基在E蛋白结构域Ⅲ茎-锚区的一个α螺旋中,对蜱传脑炎病毒(Tick-bore encephalitis virus,TBEV)的研究已证实此茎-锚区的结构完整性对prM-E蛋白异源二聚体的稳定性是必需的,而该二聚体在JEV吸附和穿入宿主细胞的过程中起重要作用。

  随着生物信息学的发展,人们利用生物信息学方法对乙脑病毒E蛋白的三维结构进行了预测,发现在乙脑病毒E蛋白活性区(E1-410)中存在着3个活性结构域。JEV毒力相关位点可能集中在3个结构域。结构域Ⅲ的远侧面,有一类似IgC的结构,可能与受体的结合有关;结构域Ⅱ的底部,可能与pH依赖的融合活性相关,在该空间结构相应的位置上氨基酸残基的变异会导致病毒毒力的变化;结构域Ⅰ/Ⅲ交界处与cd环相对区域的氨基酸突变导致毒力发生了改变[18]。Vrati及Hasegewa等的试验证实了这一预测;Arroyo J等根据上述预测的E蛋白空间结构,提出E蛋白中有10个决定JEV毒力表型的氨基酸位点,并用定点突变的试验方法加以验证。这些位点多存在于E蛋白各个结构域交界处高度保守的发夹环模体中,各结构域表面茎区中氨基酸性质的改变,严重影响JEV毒力表型的改变。JEV的主要毒力取决于E蛋白,但决定乙脑病毒毒力的因素却不限于E基因。MandI C W等对蜱传脑炎病毒(TBEV)的研究证实,结构蛋白C上的氨基酸缺失会引起病毒毒力下降,这对乙脑病毒毒力的研究也具有一定的指导作用。有研究报道在乙脑病毒及黄病毒科的其他病毒非结构基因NS3[21]、NS4和NS5[22-23]上的变异,引起了该病毒毒力减低。这对弱毒苗减毒的分子机理的阐明具有一定意义,为解释病毒的致病性、毒力变异提供了确切的分子结构基础。

  由于JEV病毒M基因参与病毒囊膜的构成,对维持E蛋白结构是必要的,E基因与病毒吸附穿入致病和机体的免疫应答作用密切相关,它能刺激机体产生中和抗体和血凝抑制抗体,为免疫源性蛋白。李自力等[23]用乙型脑炎病毒E 基因有4个点突变的SA14-14-2株, 成功构建了一株乙脑病毒prM/E基因重组伪狂犬病病毒TK-/gG-/prM/E+,这为开展乙脑病分子生物学及多价基因工程疫苗的研究打下了坚实基础。Mori Y等[24]对1株野毒株与突变株M4243核心蛋白进行核定位研究,发现突变株M4243的核定位序列(nuclear localization signals,NLS)中有两个位点突变,使得突变株M4243在Vero细胞上生长受阻,而且病毒的嗜神经毒性也生了很大变化,表明JEV核心蛋白的NLS 对病毒在动物细胞和体外繁殖的致病机理有着重要的作用。Konishi等研究表明prM和E蛋白具有免疫源性,能诱导机体产生持久的抗体和T记忆性细胞,引起保护性免疫反应,是重组病毒接种后引起保护免疫反应的关键成分。而Mason等研究表明,在重组病毒同时表达prM、E、NS1基因时,产生的病毒样粒子的量减少,有可能是在病毒囊膜组装的某一阶段,NS1蛋白和病毒结构蛋白结合影响毒样粒子的产生和释放。但Mason B A等在发现释放的病毒样粒子在保护性免疫反应有重要作用的同时,也发现与细胞相连的E蛋白在prM存在的情况也是有效的免疫原 ,其中prM蛋白有稳定E蛋白的作用,因此prM/E基因的获得,为进一步研究prM/E蛋白的表达、单克隆抗体的制备、基因工程疫苗和基因免疫苗等方面提供了广阔的前景;通过对基因序列分析得知,克隆起主要保护作用的prM/E基因片段,用该基因制造疫苗是可行的,将为乙脑活载体疫苗的研制打下良好基础[25]。

  3 结语

  乙型脑炎病毒的毒力特性和致病机理是目前研究较多的课题,分子生物学技术的应用对此提供了良好的手段,但致病机理是一个比较复杂的过程,而且取决于多种因素,JEV基因组是RNA分子,RNA分子复制缺乏纠错机制,因此JEV的变异率较高。地理位置、气候等因素、可能导致JEV的基因型和表型发生改变。不同地方JEV分离毒株毒力和致病机理也会有一些差异,因此,研究结果不尽相同。有许多方面仍需要进一步研究,如乙型脑炎病毒减毒株减毒的分子机理、JEV的3′和5′端非编码区中氨基酸对JEV毒力变化的影响、JEV关键性位点或区域是如何起作用的、JEV的分子遗传特性与其生物学性状和功能的关系、病毒移行规律、组织嗜性等。因此,还需要在广大科研人员的不断努力下,进一步探索乙型脑炎病毒的致病机理,为今后对本病的新型预防与治疗措施提供理论依据。

责任编辑:胡文会  

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