黏膜免疫研究及在猪场中的应用实践

黏膜免疫是指动物黏膜表面，发生的特殊的免疫反应，具有复杂性和多样性。黏膜免疫首次提出概念是在20世纪60年代，自提出以来一直受国内外广泛关注。黏膜免疫系统是机体相对独立的免疫系统，由特殊的免疫细胞、免疫分子构成。黏膜免疫系统中含有大量的分泌细胞，可以产生多种抗体，在抵抗细菌、病毒等病原体方面发挥了重要作用。黏膜免疫作用机制等研究，有助于动物机体抵抗病原体，且有助于新型疫苗的开发。因此黏膜免疫的研究十分重要，对于猪疫苗研发及疾病防控等，也具有里程碑意义[1]。

1 黏膜免疫系统的构成和功能

1.1 黏膜相关淋巴组织

黏膜免疫系统由两个系统组成，分别是黏膜表面淋巴组织（具有结构）及弥散性淋巴组织（无结构）。黏膜表面淋巴组织代表有肠黏膜淋巴组织、鼻咽黏膜淋巴组织、眼结膜淋巴组织、支气管黏膜淋巴组织等。弥散淋巴组织代表有上皮淋巴细胞、固有层淋巴细胞等[2]。与黏膜免疫有关的免疫细胞主要有，M细胞、T细胞、NK细胞、B细胞、记忆B细胞等[3]。

1.2 黏膜免疫作用机理

黏膜免疫在机体内主要以两种途径发挥作用，一个是体液免疫，一个是细胞免疫，但是以体液免疫为主。体液免疫发挥作用主要依赖IgA/IgG抗体，具体以sIgA/IgG形式发挥作用。IgA抗体可以阻止病原体对黏膜表面产生破坏，进而侵入机体产生损害，但是不能激活补体。IgG抗体则可以激活补体，同时还可以产生炎症反应。黏膜免疫系统中细胞免疫主要存在于黏膜固有层，可以通过T细胞、NK细胞等发挥特异性的细胞毒功能，并且可以溶解被病原体感染的细胞[4]。

1.3 共同黏膜系统与归巢性

黏膜系统发挥作用，是借助淋巴组织、淋巴细胞、IgA抗体、IgG抗体实现的。黏膜免疫发挥作用，主要是靠淋巴细胞归巢发挥作用，淋巴细胞归巢联系了诱导位点及效应位点，从而产生免疫效应。研究表明母猪在妊娠前中后期、分娩时、哺乳期，乳腺中IgA B细胞、T细胞数量有差异。妊娠前期IgA B细胞、T细胞抗体数量较低，妊娠中期T细胞数量有所增加，IgA B细胞数量与前期基本一致。妊娠后期T细胞数量达到峰值，IgA B细胞数量有所增加。分娩时IgA B细胞数量达到峰值，哺乳期与免疫有关的基因表达继续增加。这表明B细胞的运输，对于乳腺免疫及乳汁中抗体水平，具有重要的作用。B细胞、T细胞等可以向乳腺迁移，并对乳腺免疫具有重要的调节作用。研究还发现，肠道-乳腺间存在相关的免疫线轴，这一点也预示着肠道黏膜免疫可以影响乳腺免疫。IgA B细胞从肠道到乳腺的归巢，也给口服PED、传染性肠胃炎等疫苗提供了理论基础[5]。

2 黏膜免疫抗体

2.1 黏膜 sIgA抗体

sIgA抗体是由浆细胞（效应B细胞）产生的，在黏膜免疫系统中含量最丰富，且具有重要的作用。sIgA抗体组成分为，2个单体、1个分泌片（SC）、1条J链。J链是浆细胞分泌抗体前产生的，SC是IgA穿越上皮过程中产生的。SC无免疫活性，但是能促进上皮细胞从组织中吸收SIgA，并将其释放到泌尿生殖道、消化道、呼吸道的黏膜表面，进而发挥作用。sIgA抗体具有捕捉病原体发挥免疫排斥、与溶菌酶和补体共同溶解细菌的作用，还具有中和肠毒素、配合吞噬细胞和NK细胞等细胞毒素作用（ADCC）。还具有增强抗原依赖性细胞作用，提高机体对病原体的直接杀伤能力[6]。

2.2 黏膜 sIgG抗体

黏膜 sIgG抗体在机体抗感染中有重要作用，具有抗菌、抗病毒、抗毒素的作用。IgG抗体可以与抗原结合，并激活补体使抗原被消除。 sIgG抗体不稳定，易被蛋白酶水解，也能发挥ADCC效应。管腔中的IgG抗体还可以与抗原形成复合物，经过树突细胞加工后，呈递给T细胞，发挥机体识别功能[6]。

2.3 黏膜 sIgM抗体

sIgM抗体是由5个单体构成，功能与SIgA抗体类似，是能够发挥黏膜免疫功能的高效抗体。sIgM抗体具有中和毒素、抗菌、抗病毒作用，在黏膜免疫中也发挥着重要的作用[6]。IgM抗体产生较IgG抗体早，机体出现IgM抗体说明近期被感染，可用于疾病早期诊断。

3 黏膜免疫的主要影响因素

3.1 蛋白质、氨基酸等

研究表明蛋白质、功能性氨基酸及其衍生物，对维持猪肠道结构功能及黏膜免疫方面具有重要作用。喷雾干燥血浆蛋白粉（SDAP）具有降低肠毒性大肠杆菌、诱导肠道促炎因子表达、降低肠粘膜MDA含量、改善肠道抗氧化功能等。日粮中添加精氨酸，可以维持猪肠道免疫完整性、提高猪肠道上皮细胞防御素含量及蛋白水平、激活肠道细胞表面受体及启动免疫系统。日粮中添加精氨酸，还可以增加IgA分泌细胞、T细胞数量，进而促进SIgA的合成。还有研究表明，乙酰半胱氨酸通过合成谷胱甘肽，发挥调节细胞增生及机体免疫应答，抑制氧化应激引起的炎症反应。由此可见蛋白质、氨基酸及其衍生物对黏膜免疫具有重要的影响[6]。

3.2 锌

研究表明缺锌可以导致肠黏膜分泌细胞的结构损伤，导致黏膜蛋白合成受阻，进而减弱肠黏膜免疫。日粮中添加高水平的锌，可以促进SIgA抗体的分泌、抑制炎性因子分泌、提升仔猪免疫力。不同蛋白水平的日粮中添加高剂量氧化锌，可以促进肠道绒毛长度、降低隐窝深度、促进SIgA分泌、保护肠黏膜形态。因此，锌在肠道黏膜免疫中具有重要作用，动物生产中需要保证日粮中锌的水平[6]。

3.3 维生素

廖波等研究表明，日粮添加维生素D3，可以促进断奶仔猪肠粘膜T细胞的分化及成熟，还可以促进T细胞的免疫反应及抑制具有细胞毒性T细胞发挥作用。维生素D3还具有促进sIgA分泌的作用，间接提高断奶仔猪的肠道抗病力[7]。范肖肖研究表明，维生素A可以调控对鸡的IgA、黏蛋白生成，还可以对IgA相关的细胞因子表达及黏膜上皮产生影响，进而影响鸡的黏膜免疫，在及呼吸道疾病防控方面存在潜在作用[8]。王振东等研究表明，兔子日粮中添加不同水平的维生素E，可以影响肠道sIgA水平，进而兔子肠黏膜免疫机能[8]。由上可知，维生素在动物黏膜免疫中具有重要的作用，日粮中合理的添加维生素可以保证动物的正常黏膜免疫功能。

3.4 多糖

日粮中添加牛膝多糖可以增加猪肠道sIgA的分泌、增强回肠黏膜免疫力、增减十二指肠淋巴细胞数量，提升猪肠道免疫力[6]。黄芪多糖可以增强免疫抑制小鼠胸腺、脾脏免疫力，同时可以通过调节细胞因子水平促进sIgA分泌，进而发挥免疫功能[9]。研究表明松花粉多糖在鸡肠道黏膜免疫方面也具有调节作用，具体是通过改善免疫指标及肠黏膜形态，提高鸡肠黏膜免疫力。此外松花粉多糖，还可以提高鸡肠道菌群多样性，间接提高肠道黏膜免疫力[10]。由此看见，植物多糖也能够影响动物的黏膜免疫功能，在养殖生产过程中可以靠定期添加多糖类物质，提升动物的免疫力。

3.5 益生菌

益生菌在猪肠道内发挥作用，主要体现在抑制肠道病原菌、调节肠黏膜免疫力。断奶仔猪饲粮中添加益生菌，可以提高空肠黏膜sIgA分泌量、提高空肠和回肠免疫因子含量。日粮中添加枯草芽孢杆菌，能显著提高仔猪肠道IgA分泌细胞的数量，还可以维护肠道黏膜屏障[6]。因此可以看出，益生菌在养猪场生产中具有重要作用，特别是猪肠道健康方面，可以通过日粮添加益生菌提升猪只肠道黏膜免疫力，进而预防和控制猪只拉稀。

3.6 中草药

中草药博大精深，部分重要可以提高机体免疫力，如紫锥菊、黄芪等，对于肠道黏膜免疫力提升如白头翁、鱼腥草、党参等。因此未来在禁抗时，中草药将会在猪场疾病防治方面发挥重要的作用。有研究表明通过仔猪日粮中添加白头翁、鱼腥草、党参等提取物，可以显著提高仔猪黏膜上皮淋巴细胞等免疫细胞的数量，进而加强仔猪肠道免疫学屏障[11]。中药紫锥菊在欧美等市场已经在感冒、呼吸道感染方面广泛应用，具有提升机体免疫力的作用。研究表明在饲料中添加紫锥菊，可以升动物机体免疫力、促进动物生长。紫锥菊发挥黏膜免疫作用，主要与其改善细胞表面受体通路及活化免疫因子有关[12]。未来中草药在黏膜免疫方面的方剂及机理，还需要继续深入研究，在养殖方面的应用前景也非常广阔，需要持续关注。

4 黏膜免疫的主要途径

4.1 消化道

消化道黏膜免疫，主要是通过口服疫苗方式，通过肠黏膜发挥免疫作用，不仅可以预防肠道疾病，对于呼吸道、泌尿生殖道也有一定的预防作用。但是消化道免疫也有一定缺陷，即疫苗容易受到胃酸影响，需要在佐剂或者包被方面改进才能保证黏膜免疫效果。消化道黏膜免疫主要以sIgA和肠道上皮淋巴细胞发挥作用，肠道黏膜免疫具有免疫方法简单、产生黏膜免疫效果好的特点[6]。消化道黏膜免疫，在猪腹泻防控等方面，具有很好的市场前景，需要加大相应疫苗产品的研发及改进力度。

4.2 呼吸道

呼吸道黏膜免疫主要是经过鼻腔免疫疫苗，疫苗通过接触呼吸道黏膜，产生呼吸道黏膜免疫，进而发挥保护作用。鼻腔免疫可以激活机体扁桃体的B淋巴细胞，并可以迁移到机体其他部位产生保护力。因此鼻腔免疫，不仅可以预防呼吸道疾病，也可以预防其他疾病[6]。近年来在养猪生产方面，已经应用于伪狂犬、支原体的防控，伪狂犬活疫苗、支原体活疫苗（RM48株等）可以直接通过喷鼻免疫起到良好的保护作用。未来在非瘟防控方面，呼吸道黏膜免疫也具有很好的前景。无创伤免疫有助于非瘟的防控及节省人工，养猪生产中将会具有很重要意义。

4.3 生殖道

猪生产过程中有很多病毒病，都可以通过精液传播，如伪狂犬、蓝耳、圆环等。通过精液传播此类疾病后，会导致母猪繁殖障碍等疾病。此类疾病在常规肌注免疫效果不好时，可以采取生殖道黏膜免疫接种的方式进行疾病防控，进而解决此类母猪繁殖障碍问题[6]。但是早期试验，发现蓝耳病灭活苗及弱毒苗，生殖道免疫效果不理想[13]。分析可能于当时的疫苗工艺、佐剂等有关，因此研究可以生殖道免疫的疫苗，对于母猪繁殖障碍疾病，具有重要意义。借助先进的研发设备，同时配合大量临床试验，相信未来一定会有合适的疫苗问世，届时会给猪场生产成绩提升，带来不可估量的影响。

5 黏膜免疫在猪病防控中的应用

5.1 猪流行性腹泻及传染性肠胃炎防控

猪流行性腹泻病毒（PEDV）和传染性胃肠炎病毒（TGEV）主要感染肠道，但通过对仔猪血清的病原检测发现，它们也存在短暂的病毒血症[14，15]。因此诱导肠黏膜免疫以保护肠上皮细胞是预防这两个疾病的重点。但对于低日龄仔猪来说，肠道黏膜上皮细胞再生缓慢且免疫系统发育不完善，直接进行疫苗免疫无法起到很好的效果，所以低日龄仔猪需要从初乳中获得母源抗体来抵抗猪流行性腹泻病毒和传染性胃肠炎病毒的感染，而这一被动免疫是通过“肠道-乳腺-SIgA轴”来实现的。

SIgA是肠道黏膜免疫系统产生的主要免疫球蛋白，也是乳汁中的主要免疫球蛋白，对蛋白水解酶耐受能力强，所以能在肠道内维持稳定[28，29]。诱导妊娠母猪黏膜免疫是乳汁免疫的基础，黏膜免疫产生的抗体和免疫细胞通过“肠道-乳腺-SIgA轴”迁移至乳腺，最后以乳汁为仔猪提供保护。

有研究发现，免疫TGEV灭活苗不能使乳汁中产生高水平SIgA，而天然感染或者免疫TGEV活疫苗的母猪，乳汁中SIgA抗体水平较高，这可能与活疫苗能更好的诱导产生黏膜免疫和细胞免疫有关。

齐鲁复捷（猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗）自2018年上市以来，一直在探索口服免疫方案，后备母猪口服免疫3次（140日龄2头份、161日龄2头份、182日龄2头份）、经产母猪口服免疫2次（产前40天口服2头份、产前20天口服2头份）、新生仔猪超免1次（吃初乳前1.5小时口服1头份）等方案进行探索，经过大量临床验证，临床反馈数据显示，口服免疫产生的SIgA抗体高度远高于肌肉注射，临床保护效果远好于其他免疫途径的疫苗，这与韩国活疫苗口服试验结论基本一致，证明了齐鲁复捷口服免疫的有效性。

5.2 猪轮状病毒病防控

猪轮状病毒（RV）也是引起仔猪病毒性腹泻的主要病原之一，近年来检出率逐渐升高。RV主要通过粪口传播，感染肠道黏膜，肠道黏膜免疫是抵抗该病原的第一道防线。对于RV的防控，有研究表明，口服弱毒活疫苗可有效诱导消化道产生局部黏膜免疫，产生抗体介导和细胞介导的免疫应答，接种弱毒疫苗后攻毒保护率更高，而灭活苗免疫后各项指标相对较低，这和TGEV疫苗研究结果一致[18]。而人用轮状病毒口服疫苗已经全球上市了很多年，在轮状病毒的防控上起到了不可磨灭的作用，这为兽用的疫苗的发展指明了方向。

5.3 伪狂犬防控

伪狂犬病毒（PRV）一旦感染会终身带毒，病毒定植在三叉神经，在受到外界刺激的时候，病毒会大量复制，导致猪群发病。新生仔猪伪狂犬疫苗喷鼻免疫是防控PRV的有效措施，可起到占位效应，抢占仔猪的呼吸道上皮细胞，阻止野毒感染，还能够避免母源抗体的干扰，建立机体的第一道防线。

5.4 支原体防控

猪支原体肺炎(MPS )也被称为猪的气喘病，由猪肺炎支原体(MHP )引起的一种慢性呼吸道疾病，感染后会造成饲料利用率下降、猪只生猪缓慢，通常会和圆环、蓝耳、流感等病原混合感染引起呼吸道疾病综合征，导致死淘率升高，给养猪业造成巨大的经济损失。

对于支原体的净化，理论上是可行的，但操作起来难度非常大，目前防控支原体还是以疫苗免疫为主。市场上的支原体疫苗主要是活疫苗和灭活苗，灭活苗通常需要多次免疫且无法阻止感染，但可以减轻临床症状。不同毒株活疫苗免疫方式不同，有肺内注射（168株）、胸腔注射（Z株）和喷鼻免疫（RM48株），其中，喷鼻免疫（RM48株）对猪应激更小，主要是通过诱导黏膜免疫产生保护。郑鹏研究表明，仔猪通过喷鼻免疫RM48株支原体疫苗，猪鼻拭子浸液 SIgA 抗体水平和IFN-γ 水平均显著高于不免疫对照组[19]。齐鲁支宜捷（猪支原体活疫苗RM48株）自2015年在国内第一批上市，是中国也是世界第一次实现了可以喷鼻的商品化猪支原体肺炎活疫苗，属于划时代的产品；这比中国第一个2020年上市的喷鼻免疫流感疫苗足足早了5年之久，比2022年9月4日上市的康希诺生物可吸入式新冠疫苗早了7年之久。而且齐鲁支宜捷上市7年来，超过2亿头猪的临床验证，比不免疫群体多增重5.01Kg/头，比免疫灭活疫苗多增重2Kg/头，从另一个角度诠释了粘膜免疫的威力。

5.5 蓝耳防控

蓝耳病也被称为猪繁殖与呼吸综合征（PRRS），是病毒免疫学研究中最具有挑战性的课题，目前对于其免疫应答机制并不完全清楚。PRRSV可通过呼吸道、消化道和生殖道感染，因此黏膜免疫是阻断其感染的重要途径。Basavaraj Binjawadagi等研究发现，用PRRSV-MLV疫苗配合强效黏膜佐剂结核分枝杆菌全细胞裂解物对猪进行鼻腔接种，可诱导对PRRSV感染的保护性免疫，保护猪免受同源和强毒性异源PRRSV的感染。与未接种疫苗但感染PRRSV的猪相比，接种疫苗的猪体内活性氧（ROS）水平较低。在未接种疫苗但感染PRRSV的猪中，较高的ROS生成与炎症性肺病理增加有关[20]。金光明等通过对16头二元母猪进行鼻腔接种PRRSV弱毒疫苗，结果表明，与对照组相比，接种猪子宫角、子宫体和子宫颈黏膜上皮内淋巴细胞的数量极显著增加，黏膜固有层中多见淋巴细胞聚集，形成淋巴细胞群，并向黏膜腔表面排放[21]。目前蓝耳活疫苗（R98株）可在7日龄以上仔猪喷鼻免疫已经在国内上市。

5.6 猪流感防控

猪流感 (SI)是由 A型流感病毒引起的一种猪的急性呼吸道传染病。其特征为突然发病、高热、精神沉郁、食欲废绝、阵发性咳嗽。该病呈世界范围分布，并且可感染人。疫苗接种是预防该病的重要手段，当前市场上的流感疫苗主要是H1N1和H3N2灭活疫苗。SIV主要的传播途径是经呼吸道传播，因此提高黏膜局部免疫力对阻止SIV感染有重要作用，也有学者对黏膜途径接种流感疫苗的效果进行了研究。

师小潇等将重组表达的 SIV表位多肽与黏膜佐剂大肠杆菌热敏性肠毒素LT联合免疫接种小鼠，探讨了经黏膜途径免疫接种 SIV疫苗的可行性。采用灌胃途径免疫小鼠，检测试验小鼠抗体及细胞免疫水平，结果发现，免疫组小鼠血清IgG抗体、黏膜分泌型IgA抗体和外周血T淋巴细胞数量显著高于未免疫对照组，表明猪流感病毒重组多表位抗原灌胃免疫小 鼠，能产生理想的黏膜免疫抗体和血清抗体[22]。

2003年阿斯利康上市了可喷鼻的流感疫苗FluMist株减毒活疫苗，2-49岁喷鼻0.2ml/人（0.1ml/鼻孔）；2007年澳大利亚BioDiem公司喷鼻流感疫苗上市，并授权给中国长生百克公司，2020年中国长生百克上市了中国第一个可以喷鼻的流感疫苗；这也为猪用流感疫苗的发展指明了方向。

6 黏膜免疫的意义及展望

黏膜免疫系统是机体整个免疫系统的重要组成部分，对经黏膜途径入侵机体的病原菌具有很好的防控效果。黏膜免疫途径有喷鼻、口服、点眼等，因此免疫操作更加方便，对动物的应激更小；避免了肌肉注射导致的血源传播，降低了疾病传播风险；黏膜免疫疫苗不仅可诱导局部黏膜免疫，而且产生的免疫细胞可游走并聚居于各效应部位，从而产生全身免疫应答，因此黏膜免疫是一种全面而系统的免疫方法[23]。

拿新冠疫苗来说，近日，我国新型新冠病毒疫苗研发取得了新进展，又有一款吸入用腺病毒载体疫苗和一款重组蛋白疫苗获批，该疫苗通过雾化器被雾化成小颗粒后，在呼吸之间，直接通过口腔进入人体内，到达呼吸道黏膜处。因此，它能直接激发黏膜免疫，为人体筑起面对新冠病毒的第一道“防火墙”，同时阻断病毒传播。

在疫苗研发中，黏膜疫苗占据举足轻重的地位，黏膜疫苗、黏膜佐剂、微生态制剂等与黏膜免疫相关的内容成为了研究热点[2]。但同时也存在一些问题，例如疫苗佐剂的选择、免疫途径的确定以及如何保持抗原的活性等。所以开发安全有效且稳定性好的新型黏膜疫苗是未来疫苗研究的方向，相信随着免疫学理论和技术的发展，黏膜免疫将在今后猪病防控中发挥更加重要的作用[6]。

参考文献（略）

内容来源：齐鲁动保

图片来源：齐鲁动保

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