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非洲猪瘟检测中的常见问题与分析

作者:孙华伟来源:道客巴巴时间:2022-06-24 09:13点击:

  导读

  实验室检测是非洲猪瘟防控中的重要一环,但实验室检测不是仪器与试剂盒的简单叠加,是“人、机、料、法、环”多方面结合后的有效输出。在实验室广泛普及的同时,实验室的管理、质控、结果分析、报告解读及临床指导是重中之重。结果的正确解读及与临床信息的对接是其价值所在,临床及实验室的有效结合是综合诊断的基础。

  国内猪病实验室从2010年的“懵懂”,2015年的“发展”到2018年的“普及”,给我国猪病诊断及防控工作带来了巨大帮助。尤其是在2018年8月ASF暴发后,实验室检测在ASF精准剔除(拔牙)、后ASF时代猪瘟、猪蓝耳病等重大疫病的监测评估、诊断防控及净化中必将发挥重大作用。

  1 荧光PCR检测的原理

  荧光PCR(Q-PCR)是利用荧光信号的变化,实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化[1]。在Q-PCR反应过程中,每经过一个循环,PCR产物量增加,相应的荧光信号强度也跟着增加,此时收集一个荧光强度信号。经过若干个循环后,可以得到一条以循环数(CT)为横坐标和荧光强度变化为纵坐标的“S”形荧光扩增曲线。理论上讲经过n个循环之后,模板量就会达到2的n次方。见图1。

  图1 荧光PCR原理示意图

  2 常见问题分析

  2.1检测结果出现“翘尾”,怎么处理?

  首先按照要求进行复查,复查建议重新采样。如果不方便重新采样建议对原有样本重新进行提取核酸验证,如果复查为阴性则判读阴性;如果复查还是出现“翘尾”,就要对结果仔细审核。一是要排除实验室污染,二是要对病猪信息了解清楚,从临床症状排查,如果仍没法确认,建议必须重新采样复查,如有必要可以采用另一种试剂来验证。如果出现大量的弱阳性扩增翘尾,首要原因是考虑实验室被污染,可以通过做环境样本和阴性对照做验证排除。见图2。

  图2 检测结果出现大量的弱阳性扩增翘尾

  2.2非洲猪瘟检测结果和临床诊断不符合,怎么解读?

  首先要明白“检验结果与临床不符”并非一个客观的评价,而是一种主观感觉,来源于个人的经验判断。因此并不一定就是结果有误,可能有其他方面的原因。之所以会这样,主要是由于对“不符”的来源认识不够全面,不知道除了熟悉的实验室环节以外,还有哪些方面要去分析。只有对造成不符的原因有比较系统的认识,才能做到有的放矢。下面简要介绍可能出现的原因:

  2.2.1时间因素

  非洲猪瘟病毒的感染有一个发生发展的过程,如果检测时正好处于“窗口期”,就有可能出现漏检的情况。“窗口期”并不是固定的,会随着检测方法敏感性的提高而缩短,但始终会存在。

  2.2.2空间因素

  取样部位是否合格决定了结果的可靠性。不当的取样可以导致结果假阴性的情况发生。如对活猪尽量采集喉部棉拭子及抗凝血,病死猪采集脾脏和淋巴结。

  2.2.3送检因素

  检验误差绝大多数来源于分析前阶段,标本质量决定结果是否可靠,样本的现场选择、采集、运输、处理等环节将直接影响检测结果。

  2.3采集环境样本,为什么大部分样本内标不出,偶尔个别样本检测出内标?

  因为非洲猪瘟试剂检测的是猪内源性内标,环境样本有时不含有猪源细胞,所以检测不出内标;偶尔检出内标,可能该环境样本上有猪源性细胞黏附,故而检出内标。

  3 小结

  制定科学合理的日常监测及异常检测方案,避免过度、盲目检测;检测人员要专人专事,执行标准化、流程化、固态化的“simple and good”检测。

  3.1谨防移液器污染

  核酸提取、试剂加样等不同操作做到移液器专用;在检测过程中,所有试剂要放置正前方,不可从敞口的试剂上方经过;提倡空白/阴性对照要从核酸提取开始。对于污染:移液器的污染最为常见,通常是由于操作不慎将样品或提取物吸入枪内或粘上吸头,因而加样吸取时要十分小心,慢吸、不要多次抽吸,避免交叉污染或产生气溶胶污染。

  3.2喷洒专用核酸祛除剂

  实验完毕,工作台面、超净台、生物安全柜、移液器、离心机、荧光PCR仪等要使用专用的核酸祛除剂(84消毒液对仪器会有腐蚀作用)进行消毒处理;实验室一旦污染,务必暂停使用,待有效处理、认真评估后再复用。

  来源/猪业科学

责任编辑:猪易论坛官方号  

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