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猪皮炎肾病综合征实验室诊断及控制

作者:齐新永 等来源:互联网时间:2009-02-14 10:30点击:

摘 要:应用病理学和PCR方法,对浙江某猪场送检的疑似猪皮炎肾病综合征(PDNS)病猪进行诊断。结果发现肾脏呈现纤维蛋白性肾小球肾炎变化,真皮及皮下血管表现为坏死性脉管炎,淋巴组织中大量淋巴细胞缺失、多核巨细胞浸润,PCR扩增产物显示猪圆环病毒2(PCV-2)阳性。结果表明,该猪场感染了PCV-2,并表现为PDNS的病理特征。 

关键词:猪皮炎肾病综合征;组织病理学;猪圆环病毒2型;聚合酶链反应 控制

 

猪皮炎肾病综合征(Procine dermatitis and nephropathy syndromePDNS)是与猪圆环病毒2(PCV-2)感染相关的一种新的疾病,据报道,PDNS的发生与PCV-2感染紧密联系在一起。PCV-2最早是1996Clark等从加拿大的无特定病原(SPF)猪中分离鉴定的,并认为是引起断奶后仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原体[1-3]。在英国等国家的PDNS发病猪群病死率在0.25%20%,甚至更高,死亡猪多呈急性肾衰竭,未死亡的病猪一般在发病后7 d10 d康复[4]。近年来我国对猪圆环病毒感染的报道较多,但大多为PCV-2与其他疾病混合感染,而对猪皮炎肾病综合征的病例报道很少,本试验对临床疑似PDNS1例病猪进行了病理学观察和PCR检测,现将结果报告如下。 

 

1 材料与方法 

 

1.1 动物来源 

 

浙江某猪场饲养长白肉猪400余头,饲养至65 kg左右时,10头猪后肢、会阴、胸、腹和耳朵等部位皮肤开始出现圆形或不规则的红色或紫红色斑块,有的坏死后形成结痂,病猪体温、食欲和精神状态变化不大。其中1头死亡,被送到上海市动物疫病预防控制中心诊断。

 

 

1.2 病理学观察  

 

对送检病猪进行大体剖检,观察并记录病理剖检变化。取病变皮肤、肺脏、肾脏、肝脏、脾脏、淋巴结、扁桃体等组织用100 mL/L甲醛溶液固定,常规石蜡包埋、切片,苏木素-伊红(HE)染色,显微镜观察。 

 

1.3 PCR检测样品 

 

1.3.1 样品前处理 取病猪肺脏、肝脏、脾脏、肾脏和淋巴结,混样剪碎、研磨、PBS匀浆,7 500 r/min离心5 min,取上清液备用。 

 

1.3.2 病毒DNA的提取 按核酸滤膜提取说明书进行,购自香港基因芯片有限公司。取待检匀浆上清液250 μL,加500 μL buffer V-A混匀,室温静置5 min;加125 μL buffer AP2,和125 μL buffer V-B,颠倒混匀;12 000 r/min离心5 min,取850 μL上清于装有柱子的2 mL离心管中;5 000 r/min离心1 min,弃废液,加700 μL buffer W1A6 000 r/min离心1 min,弃废液,加700 μL buffer W2漂洗液;12 000 r/min离心1 min,弃废液,加700 μL buffer W2漂洗液;12 000 r/min离心1 min,将柱子套入一新1.5 mL管,加40 μL buffer TE;室温放置1 min,12 000 r/min离心1 min;管中收集的即为提取的病毒DNA,-20 ℃保存备用。 

 

1.3.3 猪圆环毒病的PCR检测 酶及其他PCR所需试剂购自宝生物工程(大连)有限公司。设计特异性引物,预扩增片段大小为1 154 bp。上游引物P15′-CCG CGGGCTGGCTGAACTT-3′;下游引物P25′-ACCCCCGCCACCGCTACC-3′(引物由上海鼎安生物有限公司合成)PCR反应体系:10×PCR buffer(MgCl2)2.5  μLdNTPs(2.5 mmol/L)2.0 μL,引物(25 pmol/μL)1  μLTaq DNA聚合酶(5 U/L)0.5 μLDNA模板4.0  μL,加双蒸水至25 μLPCR反应条件:预变性94 ℃ 5 min94 ℃ 1 min53 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min 35个循环;72 ℃延伸7 min。取5  μL PCR产物在11 g/L的琼脂糖凝胶上进行电泳(电压100 V,电泳30 min),在凝胶成像系统上观察目的片段。 

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