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畜禽疾病防治中的微生物学检验技术

作者:康大夫 编辑来源:动物生物技术网时间:2008-05-31 13:28点击:

1.7畜禽疾病防治中的微生物学检验技术
1.7.1需氧性细菌分离培养法
平板分离培养法 为常用的细菌分离培养法。平板划线培养的方法甚多,可按各人的习惯选择应用,其目的都是使被检材料作适当的稀释,以求获得独立单在的菌落,防止发育成菌苔,以致不易鉴别其菌落性状(图1-7-1)。划线培养时须注意以下几点:
  1.左手持皿,用左手拇指、食指及中指将皿盖揭开成20°左右的角度(角度愈小愈好,以免空气中的细菌进入皿中将培养基污染)。
   2.右手持接种环,将材料少许涂布于培养基边缘,然后将接种环上多余的材料在火焰中烧毁,当接种环冷却后,再与涂料之处轻轻接触,开始划线(图1-7-2)。
  3.划线时先将接种环稍稍弯曲,这样易和平皿内琼脂面平行,不致划破培养基。
  4.划线中不宜过多地重复旧线,以免形成菌苔。
芽孢需氧菌分离培养法
  若疑材料中有带芽孢的细菌,先将检查材料接种于一个管的液体培养基中,然后将它置于水浴箱中,加热到80℃维持15~20min,再行培养。材料中若有带芽孢的细菌仍可存活而发育生长,不耐热的细菌繁殖体则被杀灭。先做增菌培养,然后再按上述平板分离法分离培养。
利用化学药品的分离培养法
  1.抑菌作用:有些药品对某些细菌有极强的抑制作用,而对另一些细菌则否,故可利用此种特性来进行细菌的分离,例如通常在培养基中加入结晶紫或青霉素抑制革兰氏阳性菌的生长,以分离革兰氏阴性菌。
  2.杀菌作用:将病料如结核病料加入15%硫酸溶液处理,其他杂菌均被杀死,结核菌因具有抗酸性而存活。
  3.鉴别作用:根据细菌对某种糖的分解能力,通过培养基中指示剂的变化来鉴别某种细菌。例如远藤氏培养基可以用作鉴别大肠杆菌与沙门氏菌。
  4.通过实验动物分离法:当分离某种病原菌时,可将被检材料注射于感受性强的实验动物体内,如将结核菌材料注射于豚鼠体内,杂菌不发育,而豚鼠最终必得慢性结核病而死。实验动物死后,取心血或脏器用以分离细菌。有时甚至可得到纯培养。
1.7.2厌氧菌的分离培养
厌氧菌需有较低的氧化还原电势能才能生长,在有氧的环境下,培养基的氧化还原电势较高,不适于厌氧菌的生长。为使培养基降低电势,降低培养环境的氧压是十分必要的。现有的厌氧培养法甚多,常用的主要是生物学和物理学方法,可根据各实验室的具体情况选用。
生物学方法中 培养基中含有植物组织(如马铃薯、燕麦、发芽谷物)或动物组织(新鲜无菌的小片组织或加热杀菌的肌肉、心、脑等),由于组织的呼吸作用或组织中的可氧化物质而消耗氧气,组织中所含的还原性化合物如谷胱甘肽也可以使氧化还原电势下降。另外,将厌氧菌与需氧菌共同培养在一个平皿内,利用需氧菌的生长将氧气消耗后,使厌氧菌能生长。其法是将培养皿的一半接种吸收氧气能力强的需氧菌,另一半接种厌氧菌,接种后将平皿倒扣在一块玻璃板上,并用石蜡密封,置37℃恒温箱中培养,2~3天后,即可观察到需氧菌和厌氧菌先后生长。
物理学方法 利用加热密封、抽气等物理学方法,以驱除或隔绝环境或培养基中的氧气,使形成厌氧状态,有利于厌氧菌的生长发育。
  1.厌氧罐法:将接种好的厌氧菌培养皿依次放于厌氧罐中,先抽去部分空气,代以氢气至大气压。通电,使罐中残存的氧与氢经过铂或钯的催化而化合成水;使罐内氧气全部消失。将整个厌氧罐放入孵育箱培养。本法适用于大量的厌氧培养。
  2.真空干燥器法:将欲培养的平皿或试管放入真空干燥器中,开动抽气机,抽至高度真空后,替代以氢、氮或二氧化碳气体。将整个干燥器放进孵育箱培养。
  3.高层琼脂法:加热融化高层琼脂,冷至45℃左右接种厌氧菌,迅速混合均匀。冷凝后37℃孵育,厌氧菌在近管底处生长。
  4.加热密封法:将液体培养基放在阿诺氏蒸锅内加热10min,驱除溶解于液体中的空气,取出,速置于冷水中冷却。接种厌氧菌后,在培养基液面被覆一层约0.5cm的无菌凡士林石蜡,置37℃孵育。
1.7.3药敏试验
药敏试验常用的方法为纸片法,具体操做方法如下。
1.用在火焰上灭菌的接种环挑取待试细菌的纯培养物(量要适当多一点),以划线法涂布于普通肉汤琼脂或鲜血琼脂平板(磺胺药的药敏试验要用无胨肉汤琼脂平板),尽可能涂布的密而匀。
  2.用灭菌尖头镊子夹取各种干燥抗菌药物纸片,分别紧贴在上述涂布的平板上。一般在中央贴一种纸片,四周等距离贴若干种纸片。这样一只平板可同时贴5--8种抗菌药物纸片。
  3.将平板底部朝上置入温箱培养,取出观察结果。
经培养后凡对该菌有抑制力的抗菌药物,在其纸片周围出现一个无细菌生长的圆圈,称为抑菌圈。抑菌圈越大表示该菌对此药物敏感性越高,反之越低。若无抑菌圈则说明该菌对此药具有耐药性。所以判定结果时,应按抑菌圈直径大小(以mm为单位)来作为判定敏感度高低的标准。

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