朱惠玲，谢小利，刘玉兰，黄晶晶
肠黏膜是机体抵抗外源物质及微生物的重要免疫屏障，同时也是全身器官的“受损门户”，肠源性感染可能会导致机体多脏器功能衰竭。因此，完整的肠黏膜及其免疫系统在抵抗病原微生物感染中具有重要的作用。肠黏膜免疫屏障包括肠集合淋巴结、肠黏膜上皮和固有层淋巴细胞及其他免疫细胞。由于断奶仔猪的消化道发育还很不完善，对外部因素的变化比较敏感，易引起“早期断奶应激综合症”，表现为采食量下降，生长受阻和腹泻，给养殖业带来巨大损失，而肠黏膜受损；免疫功能降低是导致仔猪腹泻的主要原因之一。应激反应是处在健康和疾病之间的一种过渡状态，它是一个动态过程，包括应激源、应激反应、整个应激系统的各种因素间的互相影响及动态过程中各阶段的反馈作用。应激对消化道的典型损害是应激性溃疡。LPS模型是研究仔猪“断奶应激综合症”的经典模型。仔猪注射LPS后会出现急性细菌感染症状，如厌食、发热。近年来，国内外学者从不同角度分析LPS刺激对断奶仔猪的影响，但LPS对肠黏膜免疫屏障影响研究未见报道，本研究通过对断奶仔猪腹膜注射一定剂量LPS建立免疫应激模型，探讨仔猪应激后肠黏膜免疫屏障的变化，旨在为仔猪断奶应激机理的研究提供参考。
1材料与方法
1．1试验动物选用(21±1)d杜长大断奶仔猪12头，体重(5．78±0．26)kg。
1．2 试验设计 将仔猪根据体重随机分为对照组和LPS组，每个处理6个重复，每个重复l头猪，经过7 d适应期后开始正式试验。禁食12 h后，LPS组仔猪腹膜注射l00 μg／kg BW LPS(大肠杆菌血清型为055：B5，Sigma)，对照组注射等量生理盐水。48 h后将所有仔猪屠宰，打开腹腔，取肠组织样品。
1．3肠黏膜免疫测定
1．3.1 肠上皮间淋巴细胞、杯状细胞计数采取中段十二指肠、空肠和回肠，生理盐水冲洗，4％多聚甲醛固定，常规石蜡包埋、切片，苏木素一伊红染色。十二指肠、空肠、回肠各取2张切片，在400倍光镜下每张切片选取6根完好绒毛(绒毛完好、走向平直)，测量100个肠上皮细胞中所含杯状细胞、淋巴细胞数，并求出每个样品十二指肠、空、回肠上皮间杯状细胞、淋巴细胞平均值。
1．3．2 回肠集合淋巴结细胞增殖计数取回肠石蜡切片2张，二甲苯-乙醇梯度脱蜡至水，3％H202处理，蒸馏水洗涤，牛血清白蛋白(BSA)封闭，滴加PCNA抗体(武汉博士德生物工程公司)，4°C过夜，PBS(0．Ol moL/L，pH 7．3)洗涤，滴加生物素标记二抗，37℃反应30 min，PBS洗涤，滴加链霉素亲和素一生物素-过氧化物酶复合物(SABC)，37℃反应30 min，PBS洗涤，DAB显色，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。400倍光镜下每张切片随机选取5个完整淋巴滤泡，计数每l00个细胞中增殖细胞数，并分别求出每个样品的增殖细胞平均值。
1．3．3 回肠集合淋巴结细胞凋亡计数 取回肠石蜡切片2张，二甲苯一乙醇梯度脱蜡至水，3％H2O2处理，蛋白酶消化20 min，蒸馏水洗涤，滴加TUNEL反应液(武汉博士德生物工程公司)，37℃反应2 h，Tris缓冲液(TBS)洗涤，滴加封闭液，室温反应30 min，甩干，加生物素抗地高辛抗体(Anti—DIG—Biotion)，37℃反应30 min，TBS洗涤，滴加链霉素亲和素一生物素一过氧化物酶复合物(SABC)，37℃反应30 rain，TBS洗涤，DAB显色，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。400倍光镜下每张切片随机选取5个完整淋巴滤泡，计数每100个细胞中凋亡细胞数，并分别求出每个样品的凋亡细胞平均值。
1．3．4肠黏膜肥大细胞计数另取十二指肠、空、回肠石蜡切片各2张，改良甲苯胺蓝染色。在400倍光镜下每张切片随机选取10个视野计数肥大细胞数，取平均数为该动物该部位肥大细胞数量。
1．4统计分析数据采用SPSSl0．0软件处理，检验分析LPS组和对照组之间的显著性差异。
2结 果
2．1 小肠上皮间淋巴细胞和杯状细胞LPS应激对小肠黏膜上皮间淋巴细胞和杯状细胞数的影响见表1。上皮间淋巴细胞是散在分布于肠绒毛上皮间的一群特殊淋巴细胞，多数位于上皮细胞基底膜附近，以小型细胞为主，胞核大而圆，深染，胞浆少；杯状细胞散在分布于肠上皮柱状细胞之间，细胞呈高脚杯状。从表l可看出，LPS应激降低断奶仔猪十二指肠、回肠上皮间淋巴细胞数，且与对照组相比，差异极显著(P<0．01)。LPS刺激可不同程度增加小肠杯状细胞数，但与对照组相比，各肠段杯状细胞数差异不显著(P>0．05)。
2．2 回肠集合淋巴结增殖、凋亡细胞 回肠集合淋巴结增殖和凋亡细胞分布。增殖和凋亡细胞位于淋巴滤泡中央，阳性细胞均称棕黄色。LPS组回肠集合淋巴结增殖阳性细胞稀疏(P>0．05)，说明LPS刺激抑制回肠集合淋巴结细胞的增殖；与之相反，LPS组回肠集合淋巴结凋亡阳性细胞显著增多(P<0．05)，说明LPS刺激促进了回肠集合淋巴结细胞凋亡，见表2。
2．3 小肠黏膜肥大细胞 经改良甲苯胺蓝染色后，肥大细胞呈紫红色，形状多样，有圆形、椭圆形、梭形，大小不一。小肠肥大细胞多存在于肠腺周围。LPS刺激对小肠黏膜肥大细胞数的影响见表3。由表3可知，LPS刺激提高小肠各段肥大细胞数，与对照组相比，差异极显著(P<0．Ol)。
3讨论
LPS是革兰氏阴性菌细胞壁的成分，在正常及病理情况下主要通过胃肠道进入体内。LPS注射进入体内，可使人和动物出现应激反应，因此，LPS模型是现代动物营养免疫学中常用的仔猪免疫应激模型。本研究通过断奶仔猪腹膜注射LPS，探讨免疫应激对肠黏膜屏障的影响。
胃肠道不仅是营养物质消化、吸收的器官，也是机体重要的保护性屏障。肠黏膜免疫屏障由肠黏膜上皮内和固有层免疫细胞和免疫分子组成。肠上皮细胞是仔猪抵抗饲料毒素和外来致病菌的第1道防线，其表面不仅有毒素、细菌受体，而且还包含具有一定免疫功能的淋巴细胞和杯状细胞。上皮间淋巴细胞主要为T细胞，可参与黏膜免疫应答反应，在肠道免疫防御中起重要作用。大量研究表明，日粮抗原及病原微生物可使断奶仔猪小肠上皮间淋巴细胞数增加。而本试验发现，断奶仔猪LPS应激后，小肠(十二指肠、空肠)上皮问淋巴细胞显著减少。这可能是由于腹膜注射LPS引起小肠黏膜诱导性一氧化氮合成酶过度表达，从而产生过多的一氧化氮，破坏细胞的呼吸功能，加速小肠上皮细胞的凋亡。因此，上皮问淋巴细胞数减少。LPS对小肠上皮间淋巴细胞的影响未见报道，其作用机理还有待进一步研究。
肠黏膜肥大细胞是黏膜免疫乃至系统免疫的重要效应细胞之一，肥大细胞参与机体的免疫防御和免疫调节。功能性消化不良及寄生虫感染时，肠黏膜肥大细胞增多，有关LPS对肥大细胞的影响报道较少。仔猪腹膜注射LPS可显著增加肠黏膜肥大细胞数量。由此可见，应激可刺激肠黏膜肥大细胞数目增多。研究表明，在应激状态下，肥大细胞分泌的类胰蛋白酶，可裂解肠细胞表面存在的活化蛋白酶受体-2，从而使肠细胞通透性增加。本试验发现，LPS组仔猪肠黏膜形态不完整，大量肠绒毛断裂、溶解，这可能与肥大细胞的变化有关。
肠黏膜集合淋巴结是肠黏膜免疫系统的诱导部位之一。PP结的作用是摄取抗原、启动免疫应答和调节IgA的产生。McEwen等研究表明，应激可导致大鼠胸腺退化，巨噬细胞活力下降。但应激对外周免疫组织的影响报道较少。本试验发现，仔猪注射LPS后，回肠PP结免疫细胞凋亡显著增加，这可能是免疫应激后所造成的免疫抑制。
4结 论
断奶仔猪LPS应激可导致肠黏膜免疫屏障功能改变，进而加重机体急性感染症状。
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