陈申秒，李 郁，谢玉洁，王桂军，魏建忠
自2006年入夏以来，我国南方地区许多猪场发生了以高热、呼吸困难、皮肤发红为主要特征的流行性疾病—猪“高热病”，具有高发病率和高死亡率，给养猪业造成了严重的经济损失。为弄清其病因，各地相关学者对此进行了大量的研究，最后证实猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV)变异株是本次猪高热病的主要病原。PRRSV感染能严重损害机体的免疫器官，造成免疫抑制，从而继发其他传染病。临床研究发现，PRRSV单独感染引起的病理变化多为间质性肺炎，然而，发生高热病的猪表现的病变情况则较为复杂和严重，表明PRRSV与其他病原体(如猪圆环病毒2型、副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌等)的继发和混合感染是引致猪“高热病”发生的原因所在。
安徽省许多地方也同期发生了疫情较为严重的猪“高热病”，为研究和分析病猪由PRRSV引起的的继发或混合感染情况，本试验应用常规方法和PCR技术从安徽省多个猪场PRRSV检测阳性的病料中进行多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida，Pm)的分离鉴定，并确定其血清型，从而为安徽省猪“高热病”的综合防控提供可靠的理论依据和技术支撑。
1材料与方法
1．1试验材料
1．1．1病料
采集安徽肥西、庐江、肥东、定远、桐城五个地区(代号为FX、LJ、FD、DY、TC)猪场病料(肺脏)共计49份，经RT．PCR，PRRSV检测均为阳性。
1．1．2参考菌株
多杀性巴氏杆菌(A型)由本实验室保存，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌购自中国科学院微生物所。
1．1．3主要试剂
5％胎牛血清肉汤、普通琼脂、鲜血琼脂等培养基自制；葡萄糖等细菌微量生化反应管以及靛基质、硝酸盐还原试剂盒均购自杭州微生物试剂有限公司；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、TaqDNA聚合酶、MgCl2、dNTP、DL2000DNA Marker等购自上海生工生物工程技术有限公司。
1．1．4 引物
根据Townsend等报道合成Pm种与型特异性引物，由上海生工生物工程技术有限公司合成，见表1。
1．2细菌分离培养
无菌采取病料，接种于5％胎牛血清肉汤，37 ℃振荡培养l8～24 h后，分别转种到普通琼脂平板、鲜血琼脂平板和麦康凯培养基，37℃培养24 h，挑取可疑菌落染色、镜检。
1．3生化试验
将分离菌纯化后，接种于上述各种生化培养基中(用前加入5％胎牛血清、0．01％NAD)，37℃培养24～48 h。
1．4细菌DNA模板的制备
将分离纯化菌接种到5％胎牛血清肉汤中，37℃、l00 r／min振荡培养24 h，取5μL菌液直接作为DNA模板。
1．5 Pm种和型的PCR鉴定
反应体系：总体积25μL，其中10×PCR Buffer 2．5μL，MgCl2(25 mmol/L)1．5μL，Pml、Pm2、PmAl、PmA2(10 pmoL／L)各1 μL，10 mmol／LdNTPs 0．5μL，ddH20 13μL，DNA模板5μL。反应条件：95℃预变性5 min；94℃变性30 S，55℃退火30 S，72℃延伸45 S，共35个循环；72℃延伸10min。
1．6 PCR产物分析
取5μ L PCR产物经1％琼脂糖凝胶(含0．5μl/mL溴化乙锭)在80 V电压下电泳40 min，凝胶成像仪上观察、拍照结果。
1．7金黄色葡萄球菌抑菌试验
金黄色葡萄球菌在生长过程中的代谢产物之一是透明质酸酶，A型Pm的荚膜成分对其敏感，可产生生长抑制现象。将分离鉴定的Pm以10 mm的间隔划线接种到鲜血琼脂培养基，然后以金黄色葡萄球菌垂直划线，37℃培养24 h，观察金黄色葡萄球菌接种线周围Pm是否发生菌落抑制或消失现象。
2 结果
2．1细菌分离培养
在49份PRRSV检测阳性病料中分离到7株疑似Pm。分离菌在鲜血琼脂培养基上生长良好，初为透明、边缘整齐的露珠样菌落，24 h后为灰白色、圆形、微隆起光滑菌落，不溶血；在麦康凯培养基上不生长，普通琼脂培养基上生长贫瘠。在加5％胎牛血清的肉汤中振荡培养12 h出现浑浊。单个菌落革兰氏染色见阴性小杆菌，5％胎牛血清肉汤培养36～48h后菌液染色可看到荚膜，美蓝染色可见两极浓染。7株分离菌均符合多杀性巴氏杆菌生长特性。
2．2生化试验
7株分离菌生化试验结果见表2，均与多杀性巴氏杆菌生化特性相符合。
2．3 Pm种的PCR鉴定
7株分离菌均扩增出大小为457 bp的目的条带，为多杀性巴氏杆菌。
2．4金黄色葡萄球菌抑菌试验
在金黄色葡萄球菌接种线周围，7株Pm周围均出现明显生长抑制现象，初步判定为A型Pm。
2．5 Pm型的PCR鉴定
7株Pm均扩增出大小约1 048 bp大小的的目的条带，属于A型Pm。
3讨论
多杀性巴氏杆菌是猪繁殖与呼吸道综合征发病过程中主要继发病原菌之一。在49份PRRSV检测阳性的病料中，分离到细菌l8株，经鉴定7株为Pm，2株为副猪嗜血杆菌，3株为链球菌，其他细菌6株，其中Pm检出率为l4．3％(7／49)，与副猪嗜血杆菌4．1％(2／49)、链球菌6．1％(3／49)的检测结果相比，Pm分离率最高，显示安徽省猪“高热病”的发生与PRRSV引起的继发或混合感染Pm密切相关。因此，在加强猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟等重大疫病免疫的同时，应增强猪体抵抗力，减少应激，防止细菌继发感染。
根据荚膜抗原的不同，Pm分为A、B、D、E、F共5个血清型，其中A、B和D型已在猪中发现，从肺炎病例中分离出的最常见血清型是A型。Pijoan从肺脏分离的Pm有87．5％为A型，l2．5％为D型；Robea报道从有肺炎症状猪分离的Pm 75％为A型，l3％为D型；李永明等对13株Pm进行荚膜抗原PCR的检测显示8株为A型。本次试验主要是从发病猪的肺脏进行细菌分离，7株Pm均属于A型，与国内外的研究报道相一致，从而表明A型是当前继发感染的多杀性巴氏杆菌的主要血清型。由于Pm的各血清型之间多无交叉免疫反应性，因此分析当地流行的Pm血清型对于该病的防治及疫苗的研究具有意义。
目前对猪多杀性巴氏杆菌病的微生物学诊断常采用病变组织的涂片染色镜检和病原分离、生化反应及动物试验等，若要鉴定荚膜抗原型还需用抗血清甚或单克隆抗体进行血清学试验。在猪多杀性巴氏杆菌病的快速诊断上，常规方法存在着一定的局限性。本试验同时采用了常规方法和PCR技术进行Pm分离鉴定，其结果相一致。由于PCR技术具有快速、简便、特异、灵敏的优点，并且可以进行荚膜抗原型的特异性检测，避免了血清学鉴定的不便，因此在Pm及其血清型的鉴定方面，PCR方法具有实际应用价值。
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