刘作华，陈代文，龙定彪，杨飞云
动物体脂的沉积始终处于一个动态平衡，体脂含量的多少取决于脂肪合成和分解2个过程。一方面动物的体脂沉积所需要的脂肪酸大多来自脂肪酸的从头合成，即由脂肪酸合成酶(FAS)催化乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A合成甘油三酯。FAS表达水平的升高能够显著增加甘油三酯在体内的沉积，并导致肥胖。熊文中等研究发现，猪脂肪组织中脂肪酸合成酶与胴体脂肪量、胴体脂肪率呈显著正相关。另一方面，动物脂肪的水解主要靠激素敏感酯酶催化，它是脂肪细胞中甘油三酯降解的限速酶，在调控能量平衡中起重要作用。作为脂肪合成与分解2个过程中的关键酶，FAS和HSL的基因表达水平、酶活性高低对动物体脂沉积的调控具有重要意义。许多研究表明日粮能量水平明显的影响猪脂肪的沉积，但是其是否影响FAS和HSL的活性和基因表达需进一步研究。因此，本试验考察了不同能量水平对猪体内脂肪和肌肉组织中FAS、HSL的活性及其相应的基因表达水平的影响，旨在揭示能量水平调控脂肪沉积的机理。
1材料与方法
1．1 试验设计与试验动物 本研究采用单因子试验设计，从20 kg左右体重的长白X荣昌杂交猪中，选用72头日龄、体重、健康状况以及遗传差异一致的试验猪进入正式期，按性别随机分成3个组，每个组6个重复，每个重复4头猪，饲养管理按常规进行。
1．2试验日粮采用玉米-豆粕-麦麸型日粮。参照NRC(1998)和中国瘦肉型猪饲养标准(1987)确定中能量水平为l3．05 MJ／kg，高低能量水平是在中能量水平基础上提高或降低10％，分别为l4．36 MJ／kg和11．75 MJ／kg，其余指标基本一致。
1．3样品的采集和处理试验猪体重达l00 kg时，每个重复屠宰l头猪，取屠体左边8～12肋处取眼肌、肝脏及皮下脂肪，立即将各种样品编号分装保存于液氮中，-70°C保存备用。
1．4酶活性的测定
1．4．1 脂肪酸合成酶活性的测定 猪脂肪组织样品制备参照Moibi等的方法，脂肪酸合成酶活性的测定参照田维熙等的方法；肌肉和肝脏组织样品的制备和FAS活性测定均参照田维熙等。
1．4．2激素敏感脂肪酶(HSL)活性的测定脂肪组织样品制备和HSL活性的测定参照Tihon等的方法；肌肉和肝脏组织样品制备和HSL活性测定参照Tilton等和Watt等的方法。
1．5 FAS与HSL基因表达量的测定 肌肉和脂肪组织中FAS和HSL基因表达量的测定采用荧光定量PCR进行。参考GenBank中登录的FAS、HSL和B-actin序列，在保守区设计特异引物，引物由Invit—rogen生物公司合成。肌肉和脂肪组织中总RNA的提取采用Invitrogen公司的Trizol试剂，FAS和HSL基因的定量表达采用TaKaRa公司生产的荧光定量试剂盒ExScriptTM RT—PCR Kit，并采用双标准曲线法对目的基因的表达量进行分析。
1．6统计分析 数据统计分析使用SAS软件包和一般线性模型程序。所有数据采用单因素方差分析，处理问的显著性检验采用邓肯多重比较，结果以平均数±标准差表示。
2结果与分析
2．1 能量水平对各组织中FAS酶活性的影响 由表1可知，肌肉组织、肝脏组织和脂肪组织中FAS活性均随着日粮能量水平的提高而不同程度的增加。与低能量组相比，中能量组和高能量组的脂肪组织中的FAS活性分别提高了19．4％(P>0．05)和41．9％(P<0．Ol)，而中能量组和高能量组之间差异不显著(P>0．05)；肝脏组织中的FAS活性显著提高了6．6％(P>0．05)和31．4％(P<0．01)，并且中能量组和高能量组之间差异极显著(P<0．Ol)；肌肉组织中的FAS活性提高了208．4％(P<0．01)和769．9％(P<0．01)，并且高能量组的活性极显著高于中能量组，提高了182．1％(P<0．01）。
2．2能量水平对各组织中HSL酶活性的影响 由表2可知，随着能量水平提高，脂肪组织、肝脏组织和肌肉组织中的激素敏感酯酶具有降低的趋势，但各能量组之间差异不显著(P>0．05)。此外，HSL活性具有组织差异性，脂肪HSL活性极显著高于肝脏HSL活性和肌肉HSL活性(P<0．01)
2．3 能量水平对各组织中FAS基因表达量的影响
由表3可知，脂肪和肌肉组织中FAS mRNA均随着日粮能量水平的提高而不同程度的提高。与低能量组相比，中能量组和高能量组皮下脂肪中FAS mRNA表达量分别提高了13．9％(P>0．05)和42．3％(P<0．05)，而中能量水平与高能量水平之间差异不显著(P>0．05)；中能量组和高能量组肌肉组织中FASmRNA表达量分别提高了23．1％和44．6％，但各组织之间差异不显著(P>0．05)。此外，FAS mRNA表达量具有组织差异性，脂肪组织中的FAS mRNA表达量极显著高于肌肉组织(P<0．01)。
2．4不同能量水平下各组织中HSL基因表达量的影响 由表4可知，能量水平影响脂肪组织与肌肉组织中HSL mRNA基因表达。与低能量组相比，中能量组和高能量组的脂肪中HSL基因表达量分别降低了15．7％(P<0．05)和23．8％(P<0．05)，而中能量水平与高能量水平之间差异不显著(P>0．05)；中能量组和高能量组的肌肉组织中HSL基因表达量分别降低了l3．6％(P<0．05)和22．6％(P<0．05)，而中能量水平与高能量水平之间差异不显著(P>0．05)。而且，HSL mRNA表达量具有组织差异性，脂肪组织中的HSL mRNA表达量极显著的高于肌肉组织(P<0．01)。
3讨论
日粮中营养成分可以通过各种途径来调控动物基因的表达，从而影响动物的生长代谢。日粮中的能量水平对动物生产性能的研究较多也较为深入，但是能量对动物生长代谢规律和复杂的相互作用机制尚不清楚，还需要从细胞和分子水平出发，把日粮信号以及激素与基因表达的关系弄清，从而进一步扩展我们从分子水平上对动物代谢进行调控的领域和手段，以达到调控动物生产的最终目的。
3．1 日粮能量水平对生长育肥猪FAS的影响 脂肪酸合成酶在动物体脂生产、沉积中发挥重要作用。动物体脂沉积所需要的脂肪酸大多来自脂肪酸的从头合成，即由脂肪酸合成酶催化乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A转变成甘油三酯。因此，脂肪酸合成酶蛋白的多少、活性的高低对控制动物体脂沉积具有重要意义，而日粮营养是影响FAS活性和基因表达重要的因素之一。本试验中，与低能量组相比，随着能量浓度的提高，各组织的FAS的活性和基因表达量呈不同程度的提高，并且高能量处理组的提高幅度达到显著或极显著水平，这与Shillabeer等，Kim等，Clarke等在鼠上的的报道相一致。从本研究中FAS的活性和基因表达量的变化情况来看，二者呈高度相关，这可能表明能量浓度是在转录水平上调控FAS。熊文中等报道，猪脂肪组织中FAS的活性与胴体脂肪量、胴体脂肪率呈显著正相关，因此FAS活性提高，可使动物体内脂肪的合成能力提高，体脂沉积增加，这与本试验中外周脂肪、背膘厚以及肌内脂肪的变化趋势相一致。
3．2 日粮能量水平对生长育肥猪HSL的影响 激素敏感酯酶是最初发动脂肪组织中甘油三酯分解的关键酶和限速酶，也是影响动物脂肪沉积的关键酶之一。它通过催化脂肪甘油三酯释放出游离的脂肪酸，以转移到需要能量的组织中，从而在体内能量稳态控制中发挥重要作用。本研究结果表明，随着能量浓度提高，组织中HSL活性或基因表达量均呈不同程度降低，这与Tanakatl(羊)、Stich等(人)，Large等(人)的研究结果相一致。Large等旧报道肥胖病人脂肪细胞中的HSL活性、HSL蛋白浓度以及HSL mRNA的相对表达量分别较正常人降低了42．6％(P<0．01)、47．2％(P<0．05)和27．8％(P<0．05)，并且HSL蛋白表达量的降低是在转录水平上实现的，这与本研究中HSL活性和HSL基因表达量变化趋势相一致。
本研究结果表明，日粮能量水平影响脂肪沉积与FAS和HSL的活性与基因表达量相关。随着能量水平的提高，肌肉、脂肪和肝脏组织中的FAS活性增加，HSL活性降低，并且FAS和HSL活性具有组织差异性；脂肪和肌肉组织中的FAS mRNA基因表达量明显提高，而HSL mRNA表达量降低。
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