摘要：应用100条RAPD引物对三江白猪及其杂交亲本长白猪和东北民猪，以及大约克夏、圣特西和法系大白猪进行亲缘关系的DNA多态性分析。其中15条引物的扩增结果具有明显的多态性，将其扩增结果进行聚类分析，发现三江白猪与长白猪（遗传距离d为0.090）、与东北民猪的亲缘关系较近（d为0.175），与大约克夏、法系大白、圣特西猪的亲缘关系较远（遗传距离d分别为0.263、0.223、0.580）。
关键词：三江白猪、RAPD、PCR、亲缘关系
随着分子生物学技术的发展，DNA指纹分析技术已渗入到各个领域，RAPD技术以其简单、方便、易于操作的特点而迅速应用于各种动物、植物、微生物的遗传多样性的分析、亲缘关系的鉴定、抗性基因的标记等[1-7]。三江白猪是我国首次培育出的北方瘦肉型猪种，对三江白猪的分子生物学的遗传分析至今仍为空白。本实验以三江白猪及其亲本（长白猪、东北民猪）、无亲缘关系的引进品种（圣特西、大约克夏、法系大白猪）为研究对象，应用RAPD技术进行群体遗传结构分析，以期建立三江白猪的遗传背景和遗传标准，为进一步提高三江白猪种用价值，利用杂种优势的理论，选择三江白猪的理想杂交组合，进行品种间的杂交，提高后代的生产性能在分子水平上提供理论依据。
1 材料与方法
1．1动物及采样
三江白猪样品采自黑龙江八一农垦大学动物科技学院三江白猪原种猪场，东北民猪样品采自黑龙江省兰西县东北民猪原种猪场" target="_blank" href="http://js.zhue.com.cn/yangzhujishu/zhudehuanjing/200808/26-42385.html">猪场，法系大白、圣特西、大约克夏猪样品采自北京养猪" target="_blank" href="http://cj.zhue.com.cn/jinrijujiao/">养猪育种中心猪场。随机抽取6个品种猪各20头，分别于前腔静脉采血10ml，加1.75ml ACD（0.48% 柠檬酸、1.32% 柠檬酸钠、1.47%葡萄糖）抗凝[9]（因ACD不抑制PCR
反应），充分混匀后分装，待提取DNA。
1．2 DNA的提取及DNA样品池的制备
向分装的抗凝血中加入等体积的抽提缓冲液（10mml/L，Tis·Cl pH8.0，0.1mol/L EDTA pH8.0，胰RNA酶20µg/ml，0.58%SDS），于37℃水浴1小时后，再加入蛋白酶K至终浓度为20µg/ml，置50℃水浴3小时。按比例加入酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）抽提蛋白，反复抽提5000g离心15min,加乙醇沉淀，加50µl TE（10mmol/L，Tis-HCL pH8.0，0.1mmol/L EDTA）溶解DNA。同一品种20头猪的DNA样品混合，组成DNA样品池，测定其OD值，计算DNA的浓度，放在4℃冰箱内保存备用。
1．3 引物及试剂
100条RAPD随机引物（10bp）购自鼎国生物公司，Ex.taq酶试剂盒购自大连宝泰克生物公司，琼脂糖为PROMEGA公司的产品。
1．4 PCR仪
英国HYBAID公司HBPX220型
1．5 PCR反应
25µl的PCR反应体系含10×buffer（含Mg2+）2µl，引物1µl，Taq1.5U，模板20ng，dNTP200µmol/L。扩增程序为
1．6 多态性引物的筛选
比较同一引物在6个品种猪基因组DNA的扩增结果，即观察扩增带有无、数量及位置。扩增结果至少在两个不同品种猪间出现差异的引物视为多态性引物。
1．7 数据分析
对6个品种间具有多态性的引物扩增结果进行数据统计，根据Nei等的计算公式：S=2NAB/（NA+NB），d=1－S计算出随机扩增多态DNA片段的共享度S和遗传距离指数d。其中NAB是样品A和样品B的扩增产物共有的条带数目，NA和NB分别是样品A和B的扩增产物的总条带数。利用SPSS11.0软件对实验结果进行聚类分析，分析各品种间遗传距离。
2 结果
2．1 多态性引物的筛选结果
本实验从100条随机引物中筛选出25条多态性引物，其中15条引物的多态性比较好且稳定，适于做遗传分析。扩增结果见（表1）。
表1： 15条多态性RAPD引物对6个品种猪基因组DNA的扩增结果
|
引物 编号 |
序列 |
Y |
FY |
DM |
L |
SD |
SJ |
共享 片段 |
|
Q-03 |
GGTCACCTCA |
10 |
10 |
5 |
7 |
10 |
10 |
4 |
|
Q-13 |
GGAGTGGACA |
6 |
6 |
6 |
6 |
7 |
7 |
4 |
|
Q-01 |
GGGACGATGG |
5 |
6 |
6 |
7 |
6 |
6 |
3 |
|
C-05 |
GATGACCGCC |
6 |
7 |
7 |
9 |
1 |
7 |
1 |
|
C-11 |
AAAGCTGCGG |
7 |
8 |
7 |
6 |
6 |
6 |
1 |
|
K-07 |
AGCGAGCAAG |
12 |
7 |
6 |
7 |
12 |
11 |
3 |
|
K-09 |
TCTGTCGAGG |
4 |
4 |
4 |
5 |
4 |
6 |
1 |
|
G-13 |
CCCTACCGAC |
4 |
5 |
4 |
4 |
3 |
5 |
1 |
|
A-09 |
GGGTAACGCC |
5 |
7 |
4 |
8 |
5 |
10 |
3 |
|
M-03 |
GGGGGATGAG |
4 |
4 |
4 |
4 |
3 |
4 |
1 |
|
M-19 |
CCTTCAGGCA |
5 |
6 |
7 |
6 |
4 |
7 |
3 |
|
E-12 |
TTATCGCCCC |
2 |
3 |
2 |
3 |
2 |
5 |
2 |
|
E-03 |
CCAGATGCAC |
5 |
4 |
4 |
4 |
1 |
3 |
1 |
|
I-09 |
TGGAGAGCAG |
7 |
6 |
5 |
7 |
6 |
6 |
3 |
|
S-13 |
GTCGTTCCTG |
4 |
4 |
4 |
4 |
5 |
4 |
1 |
2．2 不同品种猪遗传距离指数及数据分析
根据15条引物的扩增结果，利用公式计算得到6个品种猪间的遗传距离参数，见表2。
表2 六个品种猪间的遗传距离参数
|
猪种 |
遗传距离 |
|||||
|
Y |
FY |
DM |
L |
SD |
SJ |
|
|
Y |
０ |
|
|
|
|
|
|
FY |
0.085 |
0 |
|
|
|
|
|
DM |
0.265 |
0.261 |
0 |
|
|
|
|
L |
0.208 |
0.222 |
0.226 |
0 |
|
|
|
SD |
0.494 |
0.534 |
0.561 |
0.597 |
0 |
|
|
SJ |
0.263 |
0.223 |
0.174 |
0.090 |
0.580 |
0 |
Y.大约克夏猪；FY.法系大白猪；DM.东北民猪；L.长白猪；SD.圣特西猪；SJ.三江白猪。
用SPSS11.0软件进行聚类分析得到6个品种猪间的遗传关系。
3 讨论
（1）RAPD引物为随机排列的十聚体寡聚核苷酸。如未经筛选的RAPD引物，应用于遗传结构分析则稳定性较差，而且进行亲缘关系较近个体间的RAPD反应时，其扩增结果难以表现基因组间的差异。本实验通过用100条RAPD引物对6个品种猪的PCR扩增，共筛选出具有多态性引物25个，其中15个谱带清晰，重复性好。用这15条引物对6个品种猪进行多态性扩增，分析相互之间的亲缘关系。
（2）本实验的分析结果表明三江白猪与长白猪亲缘关系最近（d为0.090），二者又与东北民猪聚成一类。从而验证了三江白猪的育种过程[8]，三江白猪是东北民猪与长白猪正反杂交，杂种一代母猪又与长白猪回交，后裔择优，自群繁殖培育成瘦肉型猪种。继承了长白猪较多的遗传特性，因此，三江白猪与长白猪的亲缘关系最近。本实验选择三江白猪与其杂交亲本及无亲缘关系的品种作为实验材料，便于比较RAPD的可信度，同时也为三江白猪的进一步选育提高品种的优良性状提供理论依据。
（3）本实验的遗传距离分析结果表明，大约克夏与法系大白亲缘关系最近（d为0.085），因法系大白为大约克夏的一个品系，在遗传上具有较近的亲缘关系。从分子水平上验证了用RAPD方法分析动物品种间遗传关系的可靠性与准确性。
（4）根据实验结果，按照杂种优势理论，可预测三江白猪与圣特西猪杂交效果较好。从本实验的遗传距离图谱可以看出，三江白猪与圣特西猪具有较远的遗传距离（d为0.580），因为圣特西是含杜洛克、皮特兰、汉普夏血统的合成系。从遗传学上考虑，用三江白猪与圣特西猪进行杂交可获得较优良的性状，从而提高该品种的日增重、胴体瘦肉率、仔猪成活率、以及提高肉的品质和减少饲料消耗等。 因此，利用RAPD方法分析不同品种猪之间的遗传关系，可以指导动物育种、繁殖并达到生产性能的最优化。
责任编辑：
