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猪伪狂犬病研究进展

作者:佚名来源:互联网时间:2015-01-12 22:51点击:

  

  摘要:伪狂犬病又称奥叶基氏病,是由伪狂犬病病毒引起的多种家畜和野生动物的一种高度接触性、急性传染病。猪是该病的主要宿主和传染源,感染仔猪出现发热、腹泻、呼吸困难、肌肉震颤、麻痹、共济失调;母猪出现繁殖障碍,给世界养猪业造成了巨大的损失。猪伪狂犬病是严重危害养猪业的重要疫病之一,国内外众多学者对其进行了大量研究,建立了多种诊断与鉴别诊断方法,研制了不同类型的疫苗。文章对该病的病原学、流行病学、临床症状、病理变化、诊断和防控方面的研究进展做一综述,重点介绍猪伪狂犬病的诊断与抗原、抗体检测方法。

  关键词:猪伪狂犬病;诊断;检测方法

  猪伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的一种高度接触性传染病。猪是本病的主要宿主和传染源,健康猪与病猪、带毒猪直接接触可感染本病。通常引起妊娠母猪流产、木乃伊胎、死胎和产弱仔;初生仔猪出现神经症状,感染率和死亡率可达100%,成年猪感染后多耐过,不发病呈隐性感染,造成长期带毒排毒,成为最危险的传染源,严重影响种猪场生产。本病广泛分布于世界各地,已有50多个国家和地区报道该病的流行,给养猪业构成很大威胁。我国自1947年首次报道该病以来,随着养猪业集约化规模化的发展,已有20多个省市报道发生了该病,并在许多种猪场呈暴发流行趋势,给我国养猪业造成了巨大的经济损失。

  1病原学

  PRV属于疱疹病毒科甲型疱疹病毒亚科,猪疱疹病毒Ⅰ型。其完整病毒粒子为圆形,直径150 nm~180 nm,核衣壳直径为105 nm~110 nm。有囊膜,囊膜表面有长约8 nm~10 nm呈放射状排列的纤突。

  PRV对外界环境的抵抗力较强,55 ℃ 50 min、80 ℃ 3 min或100 ℃瞬间才能将病毒杀灭。在低温潮湿环境下,pH 6~8时病毒能稳定存活;在干燥条件下,特别是在阳光直射下,病毒很快失活。PRV对乙醚、氯仿、福尔马林等各种化学消毒剂都敏感。

  PRV只有一种血清型,但不同毒株在毒力和生物学特性等方面存在差异。PRV具有泛嗜性,能在多种组织培养细胞内增殖,并产生明显的细胞病变和核内嗜酸性包涵体,其中以兔肾和猪肾细胞最为敏感。

  PRV基因组为线状双链DNA,大小约180 kb,G+C含量高达74%。病毒基因组由长独特区(Unique long region,UL)、短独特区(Unique short region,US)以及位于US两侧的末端重复序列(Terminal repeat,TR)与内部重复序列(Internal repeat,IR)组成。对PRV基因组序列测定发现其由72个阅读框组成,可编码70种蛋白,目前已发现和命名的有gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gK、gL、gM、gN 11种糖蛋白。编码gC、gE、gG、gI、gM和gN的基因为病毒复制非必需的,gB、gC、gD、gE和gI与病毒的毒力有关[1]。此外,胸苷激酶(Thymidine kinase,TK)、核苷酸还原酶(Ribonucleotide reductase,RR)、蛋白激酶(Protein kinase,PK)、碱性核酸外切酶(Alkaline exonuclease,AN)和脱氧尿苷三磷酸激酶(Deoxyuridine triphosphokinase,dUTPase)等几种酶也与病毒的毒力密切相关,其中TK是PRV最主要的毒力基因。糖蛋白gB、gC、gD在免疫诱导方面最为重要[2]。

  2流行病学

  PRV可引起多种家畜和野生动物感染,各种年龄的猪、牛均易感,而且猪是PRV的储存宿主和传染源,尤其耐过的呈隐性感染的成年猪是该病的主要传染源。在自然条件下PRV还能感染羊、犬、猫、兔、鼠、水貂、狐等动物。实验动物中家兔、豚鼠、小鼠都易感,但以家兔最敏感。

  PRV可通过消化道和呼吸道传播,也可通过交配、精液、胎盘垂直传播。PRV通过胎盘传递给胎儿时,由于母猪免疫球蛋白不能通过胎盘屏障,所以病毒对胎儿的感染性是致命的。空气传播是PRV扩散的最主要途径,被污染的饲料、带毒的鼠、羊等动物也可传播本病。

  3临床症状

  病猪的临床症状和病程随年龄和毒株毒力不同有所差异,哺乳仔猪最为敏感,15日龄以内的仔猪常表现为最急性型,病程不超过72 h,病死率100%,主要表现为高热、拉稀、呕吐、共济失调、角弓反张、四肢泳动等神经症状,最后昏迷死亡,第3天至第7天为死亡高峰期。断奶猪也能引起死亡,但主要表现为神经症状、拉稀、呕吐等。育肥猪则大多数伴有高热、厌食和呼吸困难,偶有神经症状,一般不发生死亡。成年猪常不呈现可见临床症状或仅表现为轻微体温升高,一般不发生死亡,耐过后呈长期潜伏感染、带毒或排毒。怀孕母猪常发生流产、产木乃伊胎或死胎,且以产死胎为主。猪伪狂犬病的另一发病特点是种猪不孕症,感染母猪屡配不孕,返情率增高;感染公猪睾丸肿胀、萎缩、丧失种用能力。

  4病理变化

  PRV感染一般无特征性病变,主要肉眼病变为上呼吸道黏膜及扁桃体出血水肿,胃肠黏膜可见卡他性或出血性炎症,中枢神经系统症状明显时,脑膜充血、出血、水肿,脑脊髓液增多。组织学病变主要是中枢神经系统的弥散性非化脓性脑膜脑炎及神经节炎,有明显的血管套及胶质细胞坏死。在脑神经细胞内、鼻咽黏膜、脾及淋巴结的淋巴细胞内可见核内酸性包涵体[1]。

  5诊断

  本病仅根据临床症状及流行病学特点很难作出诊断,确诊需要借助实验室诊断技术。为了建立适合本病诊断和流行病学调查的方法,国内外许多学者进行了大量的研究。目前,猪伪狂犬病检疫、诊断常用的方法有病毒分离、免疫荧光抗体试验、血清中和试验、酶联免疫吸附试验、核酸探针技术、聚合酶链式反应技术等。

  5.1病毒分离与鉴定

  病猪的脑组织(中脑和脑桥含毒量最多)和扁桃体作为分离病毒检样尤为理想,其次是肝、肾、脾等组织脏器。对亚临床感染的猪多采取鼻咽洗液作为分离病毒的样品。通常用100 g/L的脑组织悬液离心后取上清液作为感染动物或细胞培养物的接种材料。猪肾传代细胞、仓鼠肾传代细胞、鸡胚成纤维细胞等均可用于病毒分离。在接种后24 h~72 h可出现典型的细胞病变,将细胞培养物进行HE(Hematoxylin­eosin,HE)染色,镜检可发现酸性核内包涵体。

  将处理的病料经腹侧皮下接种家兔,通常在接种后36 h~48 h注射部位出现剧痒,动物自行啃咬,直至掉毛、破损和出血,继之四肢出现麻痹。病程很短,试验兔多于出现症状后数小时死亡。分离到病毒后应用标准阳性血清作中和试验,可采用常规的病毒稀释法或血清稀释法,如能采用蚀斑减数试验法更佳,不仅结果精确,还能根据蚀斑直径的大小,了解新分离毒株的毒力强弱情况。

  5.2血清学试验

  多种血清学方法可用于猪伪狂犬病的诊断,应用最广泛的有血清中和试验(serum neutralization test,SNT)、酶联免疫吸附试验(enzyme­linked immunosorbent assay,ELISA)、乳胶凝集试验(latex agglutination test,LAT)、间接免疫荧光技术(indirect fluorescent antibody technique,IFA)等。其中血清中和试验的特异性、敏感性最好,但由于技术条件要求高、时间长,难以在临床应用。而ELISA方法同样特异性强、敏感性高,可用于大批量样品的检测;乳胶凝集试验也以其操作简便、快速的优点在临诊上广泛应用。

  5.2.1免疫荧光抗体试验

  Stewart等首先应用荧光抗体染色法检查以病毒和病料接种的PK­15培养物,获得了良好结果。其对猪不同部位的检样做比较,发现扁桃体和淋巴结的检出率最高,大脑次之,再次为脾和脊髓。Sabo等建立了检测实验感染和自然感染PR的猪脏器冰冻切片的直接FA技术,其检出脑组织中病毒抗原的最小量为104.5TCID50/g。Allan G M等[3]建立了检测PRV实验感染猪和自然感染猪脑及咽压印片的间接免疫荧光技术,病毒抗原最低检出量为101.3 TCID50/g的脑压印片,且不需要细胞培养和冷冻切片,可在获得病料后2 h内得出结果。黄骏明等[4]建立了直接免疫荧光(fluorescent antibody,FA)技术,取病猪脑组织,主要是三叉神经、延脑、脊髓等组织作冰冻切片进行FA检查,可直接检测组织培养、试验感染和自然感染病料中的PRV,并在2 h内报告结果,适用于现地伪狂犬病的诊断。

  5.2.2微量血清中和试验

  方六荣等[5]报道应用细胞培养微量中和试验(固定病毒稀释血清法)对来自24个猪场共426份血清进行了猪伪狂犬病血清学调查,检出阳性血清171份,血清阳性率达40.1%,出现血清阳性的猪场有20个。李晓慧等[6]采用SNT和LAT两种方法对吉林省8个地区的1 050份血清进行了检测,确定吉林省猪伪狂犬病血清阳性率为21.7%,两种方法血清检出率经统计学分析差异不显著。

  5.2.3ELISA

  娄高明等[6]建立了检测PRV抗原的双抗体夹心ELISA。对人工感染兔和自然感染猪的组织脏器检测,结果发现扁桃体、脑和肺的检出率最高,其次为心、肝、脾、肾等组织。

  Moutu、Afshar、Bush、蒋玉雯等分别建立了检测PRV抗体的常规ELISA方法。黄骏明等应用混合纤维素酯微孔滤膜作固相支持物建立了斑点ELISA,并对1 337头份猪血清进行了猪伪狂犬病血清抗体检测,Dot­ELISA的敏感性显著高于SNT。曹三杰等[7]建立了Dot­PPA­ELISA,可检测IgG的最低含量为1.398×10-8 g。目前,中国农业科学院哈尔滨兽医研究所研制的Dot­ELISA试剂盒已投入使用[8]。Prudhomme I等[9]将PRV gD基因插入杆状病毒载体中进行表达制备重组抗原,建立了竞争ELISA(competitive ELISA,cELISA),利用该方法能检测到PRV感染14 d后猪血清阳转情况。

  20世纪90年代,很多学者研究建立了多种鉴别ELISA方法。其中,van Oirschot等利用感染细胞单层作抗原,抗gE表位的单克隆抗体作指标抗体,建立了检测PRV gE抗体的竞争酶联免疫吸附试验gE­ELISA。Morenkov等建立了两种检测抗伪狂犬病gE抗体的间接ELISA,其中重组­gE­ELISA是利用大肠埃希菌表达gE基因N末端氨基酸1位~125位的融合蛋白为基础而建立的;亲和层析­gE­ELISA是利用亲和层析技术从病毒粒子中提纯的天然gE蛋白为基础而建立的。这两种间接ELISA的敏感性和特异性均能区分gE基因缺失的疫苗免疫动物与野毒感染动物。Cook等建立了检测抗gG抗体的血清学鉴别阻断ELISA方法,即gG­ELISA,该方法可以区分gG基因缺失疫苗免疫动物与野毒感染动物,但其敏感性比常规ELISA低。Kit等利用表达的PRV糖蛋白gC作包被抗原,建立了gC­ELISA。国内唐勇等[10]利用gG基因表达产物建立了gG­ELISA,可特异区分gG基因缺失疫苗免疫猪和野毒感染猪。

  5.2.4乳胶凝集试验

  日本的柴因勋对比了LAT和SNT,检验了1 659份血清样品,发现LAT和SNT的相符程度达97.6% ,且由于LAT可以检测有很强凝集活性的IgM,可以早于SNT检测到PRV的抗体[9]。国内吴斌等做的同类试验也表明LAT和SNT间无统计上的差异。近年,美国已经有商品化的LAT试剂盒供临床使用。国内华中农业大学也研制成功了gG­LAT和gE­LAT试剂盒。

  5.3分子生物学技术

  5.3.1核酸探针技术

  PRV在潜伏期间,病毒基因组存在于潜伏部位,虽不进行复制和翻译,但可发生转录,存在病毒DNA和RNA。Gutekunst以H3标记的以PRV DNA为模板合成的cRNA为探针,对疫苗接种猪攻毒后采集的三叉神经节和扁桃体抽提DNA进行了杂交检查。Robin等使用微量滤管将从组织抽提的DNA转移至NC膜上,在高压力条件下和与猪细胞DNA无交叉杂交反应的探针如P32标志的BamHⅠ酶切的PRV DNA片段进行斑点杂交,可检出潜伏感染。Brown等用原位杂交检测潜伏感染也取得成功。Maes R K等[11]以生物素和地高辛标记的探针对病料组织切片进行原位杂交,可从单个细胞水平上检出潜伏感染病毒DNA。国内,郭万柱等[12]应用P32标记的PRV 全基因组和重组质粒作探针,采用斑点杂交法能检测出10 pg的PRV DNA,其灵敏度足以达到检出潜伏感染猪组织中的PRV DNA。但杂交试验在敏感性和重复性上易变,尤其是原位杂交,并且既费时又昂贵,难以推广应用。

  5.3.2PCR技术

  PCR技术以其快速、敏感、易于操作等优点在问世后迅速被广泛应用。Belak等应用gB基因引物率先建立了检测PRV的PCR方法。Jestin等从鼻拭子抽提核酸,通过扩增PRV的gD基因序列检测出了PRV。Talmage T B等[13]应用gB基因引物对活检的扁桃体细胞或实质组织进行扩增,能应用于潜伏感染的检查。其还应用gB基因的嵌套引物对PRV DNA进行扁桃体细胞内扩增,并应用原位杂交来探查细胞内扩增的DNA,大大提高了检出率。Harding M J等[14]根据已发表的PRV序列资料,设计并合成了用来扩增PRV gD基因的引物,建立了能够区分来自人和其他动物疱疹病毒的PCR方法。国内冉多良、石建平、李学伍等[15]、娄高明等[16]也分别建立了检测PRV的PCR方法,试验表明所建立的PCR方法可用于伪狂犬病的快速诊断和流行病学调查。

  此外,Scherba等根据gG和LacZ基因设计引物,建立了区分PRV疫苗株和野毒株的鉴别PCR方法。Hasebe等根据gD和gE­gI基因序列设计两对引物,对人工感染Bartha、BUK以及另外5株野毒的猪组织进行扩增,能有效地区分强弱毒株。Katz等针对gE、TK基因设计引物,应用套式PCR能将PRV野毒株和不同疫苗株有效地分开。Schang等根据PRV gE或gD基因设计两对引物,同时以猪核因子Ⅰ基因为内参照进行PCR扩增,通过Southern杂交和高效液相色谱分析扩增产物,建立了定量和鉴别PCR技术。Thiery等建立了检测PRV急性和潜伏感染猪三叉神经节中DNA的荧光素标记定量PCR方法,其灵敏度达到5个~10个拷贝靶基因。国内冉智光等根据PRV gB和gE基因的序列各设计一对引物建立了复合PCR方法,可成功地将我国常用的疫苗株Bartha K61与多个野毒株区分开,可检出10 pg病毒DNA。陈陆等[17]建立了gE/gB鉴别诊断方法,可以检测潜伏感染。刘莉娜等[18]针对PRV 的gB、gD和gE基因序列建立了多重PCR鉴别诊断方法,能有效区分野毒株和基因缺失疫苗毒,可检出106 pg三基因缺失疫苗毒和756 pg野毒株DNA。

  近年来,检测PRV与其他猪病毒病的多重PCR方法也相继建立。Huang C等[19]建立了检测PRV、猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)和猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)的多重PCR方法,该法灵敏度高,可检测出10-4ng各种病毒DNA,可应用于临床病猪的组织样品(淋巴结、肺、脾、扁桃体)检测。Cao S等[20]建立了检测PCV­2、PPV和PRV的多重PCR方法,并检测了137例多系统衰竭综合征仔猪,可用于诊断野毒感染病例。Sámi L等[21]建立了检测PRV、PPV和猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的多重PCR方法,该法特异、敏感、快速,在60 min内出结果,可用于猪重要病原体的快速鉴别诊断。

  6防控

  本病尚无有效治疗药物,疫苗的免疫接种是预防和控制猪伪狂犬病的根本措施。目前国内外已研制成功猪伪狂犬病的常规弱毒疫苗、灭活疫苗、基因缺失弱毒疫苗和基因缺失灭活疫苗,其他如病毒载体重组疫苗和基因疫苗尚处于实验室研究阶段[22-24]。其中基因缺失疫苗已在生产中发挥重要作用,尤其在美国和欧洲一些发达国家的PR根除计划中功不可没。第一代基因缺失疫苗为TK基因缺失疫苗;第二代基因缺失疫苗主要有TK-/gC-、TK-/gG-、TK-/gE-、TK-/gE-/ gG-等。国内郭万柱等研制出了PRV-SA215 gE-/gI-/TK-/ LacZ +基因缺失疫苗;陈焕春等也成功研制出PRVgG-、gE-等单基因缺失灭活疫苗和TK-/gG-、TK-/gE-等双基因缺失弱毒疫苗,并建立了相应的区分野毒感染和疫苗免疫动物的鉴别诊断方法,为我国实施猪伪狂犬病根除计划提供了相应的技术和产品。除了免疫预防之外,还应采取综合性的措施来控制猪伪狂犬病,如引种时加强检验检疫、定期对环境进行消毒、严格控制人员来往、灭鼠、经常进行疫情监测等。

责任编辑:胡文会  

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