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猪口蹄疫灭活疫苗效力检验替代方法研究进展

作者:佚名来源:互联网时间:2014-12-18 20:46点击:

  

  目前,口蹄疫灭活疫苗的效力检验方法是采用本动物进行免疫攻毒试验.此方法需要大量的非免疫本动物,存在着动物来源困难。试验成本高、周期长等问题。建立与本动物具有一定统计学关系的口蹄疫灭活疫苗效力检验的本动物替代方法是国内外亟待解决的一个问题。过去数十年中,口蹄疫灭活疫苗结合其他疫苗的研究情况,主要进行了以下几种替代方法的研究:试验动物替代法、血清学替代法、疫苗抗原定量法。但到现阶段仍没有一个像本动物攻毒试验那样确定统一的标准替代方法。为了更深入的了毹口蹄疫灭活疫苗效力替代方法的研究现状以及今后的发展方向,本文结合传统口蹄疫灭活疫苗效力检测方法,针对以上几种替代方法的研究进展展开探讨。

  口蹄疫是偶蹄动物携带的一种急性、热性和高度接触性传染病,由小RNA病毒科(Picornaviridae),口蹄疫病毒属(Aphthavirus)的口蹄疫病毒(Foot-and—Mouth Disease Virus,FMDV)所引起。由于其传播快、感染性强,给畜牧业造成巨大的经济损失,严重影响国际贸易。到目前为止,全世界仅有少数几个国家或地区属非口蹄疫疫区,世界动物卫生组织将其列为必须上报的A类疫病。防控口蹄疫的措施主要是扑杀发病动物和应用质量可靠的疫苗免疫易感动物。目前许多国家和地区在口蹄疫防制中采用灭活疫苗,因此高质量安全的灭活疫苗对于口蹄疫防控至关重要。为保证口蹄疫灭活疫苗在生产实践中安全有效的应用,疫苗的质量控制至关重要。疫苗终产品的效力试验用于评价疫苗的质量,必须严格执行国家监察当局制定的切合实际需要的效力标准。国际上通用的疫苗效力检测方法是本动物攻毒试验,欧洲国家多采用50%保护剂量(50%Protective Doses,PD50)测定法,南美国家多采用疫苗保护百分率测定法。本动物攻毒试验的动物必须是来自无口蹄疫地区、血清无任何型口蹄疫病毒中和抗体,且在规定年龄内的非疫苗免疫本动物。由于我国采取强制免疫手段控制口蹄疫的流行和暴发,这使得试验动物的获取存在相当大的困难;同时,本动物攻毒试验检验方法需要大量的非免疫本动物,成本高,试验周期长、试验要求高,具有较大的不易操作性。在国际动物卫生组织提示下,研究人员努力研究新的、可作为常规检验的方法以替代本动物攻毒试验检验方法。迄今为止,研究较多的方法主要有:血清学替代法、试验动物替代法和疫苗抗原定量法。

  1传统口蹄疫灭活疫苗效力检测方法

  传统的口蹄疫灭活疫苗效力检测方法是采用本动物疫苗免疫攻毒试验来衡量疫苗产品在特异性免疫抗原存在时减轻或消除疾病的能力的方法。用推荐免疫剂量以成品疫苗对规定日龄内的同一种系动物进行接种,经过最佳免疫反应期后,对免疫动物和对照动物同时以能引起动物发病的病毒进行攻毒,在一定观察期后根据免疫动物被保护情况衡量疫苗降低病毒攻击引起发病的能力。根据OIE标准,口蹄疫灭活疫苗效力检验方法有两种:一种是PD50测定法,一种是PGP法。PD50测定法:用疫苗50%动物保护剂量(PD钟)来评价疫苗免疫效果。欧洲药典130(European Phar-macopoeia)推荐的测定方法是:将无口蹄疫阳性血清的大于6月龄的牛分为至少3组,每组不少于5头,按规定的不同剂量对每组动物进行免疫,如分3组则分别免疫l头份、I/4头份、1/16头份,免疫3周后,对免疫动物和2头未免疫对照动物一起按规定病毒量进行同源强毒攻击,观察8d。根据各剂量发病动物的数量,按Reed—Muench法或Karber法计算PD50。PD50测定法规定,常规预防用疫苗效力每免疫剂量不少于3个PD50,紧急免疫用疫苗每免疫剂量不少于6个PD50。PGP测定法:按疫苗规定剂量免疫动物后根据攻毒保护百分率(PGP)来衡量疫苗的免疫效果。选择18—24月龄健康无口蹄疫感染动物16头,分别免疫l头份疫苗,28d后以规定的攻毒剂量及注射方法对16头免疫动物和2头对照动物进行攻毒,观察7d。疫苗保护百分率达到75%以上,判定该疫苗合格;疫苗保护百分率为62.5%一68.8%,需要进行重复检验;疫苗保护百分率小于62%,判定为不合格疫苗。动物免疫攻毒保护试验是当前检验疫苗效力的客观、有效手段;但许多研究表明,疫苗免疫效果与动物品种、疫苗毒株、流行毒株和动物的非特异免疫水平等有关,在环境改变的情况下,PD50和PGP法不能准确反应出疫苗免疫效果。动物攻毒方法和是否发病的判断存在许多分歧,影响了方法的准确性;效力试验对大量未受到疫苗保护的动物也将带来巨大的痛苦和损害,造成经济损失。PD50的试验设计还存在统计学方面的缺陷,由于每组设定的试验动物数量不足,试验的重复性和结果的再现性较差,如果增加试验动物数量,疫苗PD50结果的准确性可提高,但会极大的增加试验成本,可操作性不强。

  2试验动物替代方法

  从1954年开始有使用成年小鼠作为FMDV感染试验动物的报道。到1966年,Mayo等发现在FM-DV感染的小鼠体内有很高的FMDV特异性中和抗体。上世纪80年代初,Sutmoller等旧1用小鼠作为模型动物分析免疫小鼠的血清抗体滴度和牛抗攻击病毒感染免疫力之间的相互关系。本世纪初叶,Dus San.tos等一1用BALB/c小鼠替代牛间接评价了口蹄疫灭活疫苗的效力。成年BALB/c小鼠对FMDV敏感,能产生特异性中和抗体,但不能产生明显的临床症状,易产生耐过性;不超过5日龄的乳鼠易产生FMD临床症状并发生死亡。2007年,智晓莹等¨钊将成年BALB/c小鼠攻毒保护试验与乳鼠感染试验相结合评价口蹄疫灭活疫苗,既能检测抗体又能通过乳鼠试验判定疫苗的保护作用,为建立BALB/c小鼠模型替代本动物效力试验进行了初步研究。20世纪20年代,研究发现豚鼠感染口蹄疫病毒后具有和牛相似的临床症状,在趾部和舌面出现水泡等组织病变,从此豚鼠成为口蹄疫病毒研究的一种模型动物。到1979年,Knudsen等,不仅阐明豚鼠感染口蹄疫病毒的临床症状,而且说明豚鼠感染口蹄疫病毒后能产生特异性的体液免疫和细胞免疫。2004年,郎洪武¨引用豚鼠对13蹄疫病毒进行测毒试验,结果表明口蹄疫病毒可引起豚鼠出现规律性、典型性发病。口蹄疫病毒对豚鼠具有良好的病原性,这为豚鼠作为口蹄疫疫苗效检的模型动物的进一步研究打下基础。

  研究者将豚鼠作为试验动物,试图寻找豚鼠与本动物之间进行口蹄疫疫苗效力检验的相关性。1976年,Eissner等,列与Terpstra等,用豚鼠进行牛口蹄疫灭活疫苗的效力试验,与牛的PD卯建立了较好的相关性。2008年,高旭东u副用豚鼠模型评价牛口蹄疫灭活疫苗的效力,也证明豚鼠测定的PD蚰与牛测定的PD50。具有很好的相关性。1985年,Black¨等以豚鼠作为试验动物对猪口蹄疫灭活疫苗进行效力检验,结果显示豚鼠的log:PD50与猪的攻毒保护率具有正相关关系,并且确定了豚鼠log:PD加评价疫苗效力的临界值。2008年,Sedeh等Ⅲ1运用放射技术灭活El蹄疫病毒后制备疫苗,以两组豚鼠作为试验动物,分别免疫传统灭活疫苗和放射灭活疫苗,免疫后攻毒测定两种疫苗的PD50,从而评价疫苗的质量。从替代性试验动物的选择来看,使用标准容易确定,适合规模养殖,均一性容易控制。有研究结果表明豚鼠与本动物攻毒后的PD卯呈一定的正相关关系,但不稳定,这可能与试验环境、攻毒方法、动物发病的判定标准以及攻毒免疫剂量等因素有关”。替代性试验动物的免疫反应与本动物的区别仍然存在,而且替代性试验动物人工感染病毒时使用的是试验株,与天然感染在株系和感染途经上存在区别。

  3口蹄疫血清学效力检测替代方法

  通过检测疫苗免疫后的抗体滴度水平来评价疫苗免疫效力,检测方法主要包括病毒中和试验和各种ELISA试验。1968年,Stellman等¨驯提出了用中和抗体滴度分析疫苗效力的统计学方法;到1976年,Pay等¨引根据中和抗体滴度和疫苗效力的关系建立了疫苗的抗原剂量、中和抗体滴度和保护率的相关公式。世界各国的研究工作者都尝试用血清学方法评价疫苗的效力,以替代本动物的效力检验方法,取得了一定的进展。上世纪80年代,Black等Ⅲ1提出抗体平均值预测方法,试验建议用平均中和抗体滴度1.7410910作为疫苗合格的判断标准。2003年,Bar-nett等旧川采用bootstrap的方法进行疫苗效力测定,试验首先通过统计分析获得回归方程,将免疫21d测定的中和抗体结果代入公式预算某个稀释度的疫苗保护率。2007年,Coils等怕1采用回归方程结合ROC(Receive Operating Characteristic)曲线确定了抗体滴度最佳临界点和可疑值范围,用最佳临界点来预测某个动物是否保护,然后再计算PD卯。血清学试验不需要在动物舍内进行有毒性的操作,减少了病毒向外界散播的危险;不需要对动物进行攻毒,消除了攻毒试验给动物带来的损害;还省去了攻毒后的观察期,缩短了试验周期。抗体滴度测定使试验从定性(死亡或出现临床症状)走向了定量,排除了人为判定误差或试验动物健康状况影响试验结果;与攻毒程序相比,血清学试验可以对试验样品进行保存,当产品上市出现问题或管理机构要对疫苗进行复检时可应用保存的样品进行重复试验。有的动物有很高的抗体梯度,但攻毒后仍然发病;有的动物几乎检测不到抗体,但却受到了保护,这些现象表明仅靠抗体水平衡量动物是否被保护是欠妥的。由于不同试验室所用的检测方法、试剂以及判断标准等方面难以统一,以至这类研究结果应用于实际生产中存在困难。另外,检测免疫血清抗体效价须用非口蹄疫疫苗免疫动物,无法从根本上取代本动物的使用,动物的选择仍存在困难。

  4疫苗抗原定量方法

  FMDV在蔗糖密度梯度离心时根据沉降系数不同可以分为几种病毒粒子,分别是完整病毒(146S)、空衣壳(75S)、病毒感染相关成分(45S)和12S蛋白亚单位(12S)。146S抗原颗粒是口蹄疫疫苗中使动物机体产生保护性的主要免疫原成分,因此146S抗原颗粒的含量被视为与口蹄疫疫苗的效力具有平行关系。上世纪70年代,各种146S抗原颗粒定量的方法相继报道,如免疫扩散法,蔗糖密度梯度离心法,ELISA抗原定量法等,其中较常用的方法是蔗糖密度梯度离心法。1971年,Fayet等旧1首次建立了用紫外光定量蔗糖梯度中口蹄疫病毒粒子146S抗原颗粒的方法;1974年,Barreling等旧。在此基础上做了改进,使此方法更加精确敏感。DoelⅢo进一步发展和标准化了这个方法,并于1982年向OIE正式推荐了这个方法。1990年,Junsuke等哺。用蔗糖密度梯度离心法对口蹄疫灭活疫苗中的146S抗原颗粒纯化后,用软件CDS系统对146S抗原颗粒实现了电脑自动化定量。有研究者还开展了146S抗原颗粒含量与疫苗的本动物效力(PD∞)相关性的研究。试验证明,在一定的范围内,146S抗原颗粒的含量与疫苗效力有相关性。Rweyemamuml分析了口蹄疫灭活疫苗中抗原含量与免疫动物抗体水平的关系,确定了牛的抗体水平与疫苗146S抗原颗粒含量呈0.16log。

  目前,猪场动力网感谢您的访问。体外抗原定量试验替代灭活疫苗的效力试验存在一些障碍:其一,大量的疫苗产品中含有佐剂等成分,抗原在进行测定之前必须与疫苗中的其他成分分开,并且要保证抗原的完整性;其二,免疫试剂对146S抗原颗粒定量测定存在一些干扰,比如用ELISA方法测定抗原含量时,ELISA中的单克隆抗体不能完全辨别抗原的所有功能区域,从而使抗原的量化不能完全反映抗原的免疫原性和本动物接种疫苗后一系列复杂的免疫反应。

  5总结和展望

  口蹄疫灭活疫苗本动物效力检验替代方法的探索是国内现面临和亟待解决的一个问题,有效的替代方法应该具有很好的特异性、敏感性和重复性,而且要易于标准化。体外替代方法如血清学试验和抗原定量试验在生物安全、动物福利、效率和试验监测等方面具有优点。但这两种方法是对保护性的间接测定,仅能反映部分免疫反应的过程。如果抗体滴度或抗原含量与保护性不存在线性或其他曲线关系,或者保护性受细胞介导的免疫反应影响,血清学试验、抗原含量测定与保护性反应就不存在相关性,这样的体外替代方法很难完全替代本动物的效力检验。替代试验动物易于规模化饲养,均一性易控制。应用成本较低的动物进行试验可通过增加试验动物的数量而获得更加精确的试验数据。替代试验动物可以模拟疫苗免疫接种后抗原在体内通过网状内皮系统呈递的过程、细胞介导的免疫反应、疫苗佐剂产生的效应和靶组织的特异性等体外试验无法测定的过程。但替代试验动物模型只可能在某些方面与本动物的免疫反应和发病机理具有相似性,不可能完全复制本动物的真实情况。替代试验动物的健康状况、免疫剂量、攻毒方法等也会对试验的重复性和稳定性产生影响。伴随全世界减少或取消动物试验的需求,攻毒试验给发病动物带来的痛苦也违反了实验动物3R原则,就在科学研究中的应用。结合现阶段口蹄疫灭活疫苗效力检验替代方法的研究状况,我们认为在疫苗质量控制中,可以在生产阶段用抗原含量测定的方法保证疫苗中有效抗原的含量;而在成品疫苗的效力检验时尝试将体外检测方法与动物体内检测方法相结合进行综合评价,大批量的终产品检验可以通过体外试验数据来进行检验,从而减少试验的数量;在终产品的组分发生改变时用动物进行效力检验,以探索一种有较好重复性、可靠性和易于标准化的替代方法。

责任编辑:胡文会  

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