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猪流行性腹泻临床诊断与防治

作者:熊剑锋来源:武汉回盛生物科技有限公司时间:2015-10-15 16:08点击:


  猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea, PED)是由套式病毒目冠状病毒科冠状病毒属的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征的一种高度接触性肠道传染病。本病有一定的季节性,多发生于冬季12月至第2年2月寒冷季节,但近年来炎热的暑季也可发生。PED 在各年龄的猪均可感染,传播迅速,仔猪死亡率高。在过去的30年间,PEDV在亚洲猪场中的感染非常严重;在我国PEDV的感染,给养猪业造成了巨大的经济损失。临床上由于 PED 与猪传染性胃肠炎(TGE)的临床症状极其相似,再加上 PED 经常与其他腹泻类疾病混合感染,所以仅凭临床症状来确诊 PED 较为困难,还需进行实验室诊断。本文主要通过概括猪流行性腹泻病毒在流行病学、临床症状、病理变化以及诊断与防治方面的研究进展,希望为该病的预防和控制提供理论帮助。

  1、流行病学

  20世纪70年代初(1971年)首次在英国暴发以来,相继在比利时、德国、匈牙利、瑞士等许多欧洲国家也都发生过暴发流行。20世纪8O年代,日本、韩国、中国等一些亚洲国家也暴发了该病。我国从20世纪80年代初开始陆续有本病的流行。

  流行性腹泻病毒可在猪群中持续存在,各种年龄的猪均易感。哺乳仔猪,架子猪和育肥猪的发病率可达100%,尤其以哺乳仔猪严重。本病主要多发在冬季,夏季也有发生。我国从12月至次年2月为本病的高发期,它的发生常常是由一头猪发病后,同圈或邻圈的猪在1周内相继发病。病猪和带毒猪是主要的传染源,病毒多经发病猪的粪便排出;运输车辆、饲养工具、饲养员的工作装(工作服及鞋子)或其它带毒动物,都可作为传播媒介。

  猪流行性腹泻可单一发生,或与传染性胃肠炎病毒(TGEV)、轮状病毒、猪圆环病毒(PCV-2)形成混合感染。甚至有专家认为,当前猪场病毒性腹泻,只须考虑,PEDV感染,而不必担心传染性胃肠炎病毒(TGEV)。近年来,常常见到PEDV致病毒株变异的报道,这进一步增加了对猪流行性腹泻(PED)防控效果的不确定性,让问题变得更加复杂。

  2013年美国首次报道该病的流行,其分离株基因组序列与其他地区流行的毒株有高度的同源性。2013年古巴也报道有此病流行。至此PED近几年来呈全球性流行态势,而以亚洲的流行最为严重,病死率居高不下,给养猪业带来了重大的经济损失。

  2、临床症状

  PED最明显的症状是水样腹泻、脱水或伴有呕吐。该病常以暴发性腹泻的形式发生,发病率和死亡率差异很大,在有的种猪场,所有年龄的猪只均感染发病,发病率高达100 %。在PED广泛流行和母猪群大多有免疫力的国家或地区的种猪场中,新生仔猪很少暴发PED。该病与猪传染性胃肠炎(TGE)极为相似,只是程度较轻,传播速度较慢、哺乳仔猪病死率稍低。粪稀如水,呈灰黄色或灰色。呕吐多发生于吃食或吮乳之后。少数病猪出现体温升高1-2℃,精神沉郁,食欲减退或不食。临床症状的轻重随年龄的大小而有差异,年龄越小,临床症状越重。1周龄内仔猪常常腹泻3-4 d后因脱水而死,病死率平均为50 %,但有时高达80 %。暴发过急性腹泻的猪场,在断奶后2-3周可能出现持续性腹泻。育肥猪和母猪常呈现沉郁和厌食临诊症状,持续腹泻4-7 d,逐渐恢复正常。成年猪仅表现沉郁、厌食、呕吐等临床症状,如果没有继发其它疾病和护理得当,猪很少发生死亡。

  近几年来,在日本和韩国均有新生仔猪急性PED的暴发并出现高的致死率。

  在欧洲一些猪场,断奶猪和成年猪经常发生严重的腹泻,而哺乳仔猪,尤其是无母源抗体的哺乳仔猪不发生或仅发生轻微腹泻,发病率很低,对于这种现象至今仍未能做出很好的解释。多渠道来源的混养架子猪或育肥期间猪只暴发急性PED时,临床表现几乎一样,所有的猪只在1周内均表现腹泻,食欲稍减退,精神沉郁,粪便呈现水样。在育肥后期,PEDV感染引起的腹泻比猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)引起的腹泻猪只的腹泻要严重得多,但大多数猪只在7-10 d后康复,病死率仅为1 %-3 %,且这种死亡常见于腹泻早期或发生腹泻之前,剖检病死猪常见背部肌肉坏死。应激敏感的猪只发生PED时死亡率很高。一般来说,PEDV在架子猪和育肥猪的肠道内比在新生仔猪的肠道内更易增殖,因此,育肥猪对该病毒易感性更高,一旦发病,发病率常高达100%。

  3 病理变化

  猪流行性腹泻(PED)的病理变化主要在小肠,表现为小肠膨胀、充满淡黄色液体、肠壁变薄,个别小肠黏膜点状出血(呈红色外观),肠系膜淋巴结群水肿。在人工接种24h后,可观察到仔猪的小肠绒毛出现组织学变化,主要表现为:小肠绒毛上皮细胞空泡化、脱落,小肠绒毛变短,重症者绒毛萎缩,甚至消失。胃肠空虚,或充满胆汁样的黄色液体。其他实质性器官无明显病理变化。电镜观察可见绒毛变短,绒毛与肠腺的比率从正常的7:1降至3:1。超微结构变化主要发生于小肠细胞细胞浆中,可见细胞器减少,出现电子半透明区,接着微绒毛和末端网状结构消失,部分胞浆突入肠腔内,肠细胞变平,紧密连接消失,脱落进入肠腔。

  4 诊断方法

  猪流行性腹泻(PED)在临床症状、流行病学和病理变化等方面与猪传染型胃肠炎(TGE)无明显差异,只是PED死亡率较低,在猪群中传播的速度也较慢,确诊必须进行实验室诊断。近年来,随着分子生物学技术的不断发展,聚合酶链式反应(PCR)诊断技术因其快速、方便、特异性强、敏感和准确等优点已成为实验室最常用的检测方法。同时,病原学诊断和血清学诊断方法也有了很大的发展,经过不断的改进和完善,其诊断方法具备了简单、快速、可重复性强等特点而被广泛应用于实验室诊断。主要的诊断方法包括如下几种:

  4.1 免疫电镜法

  由于TGEV与PEDV同属冠状病毒,形状非常相似,在普通电镜下无法区别,为此需要用免疫电镜法(IEM)。IEM 法既可用已知的 PEDV 高免血清检测未知抗原,又可用已知的PEDV 抗原检测未知抗体。王继科等把抗原和抗体分别经 10 000 g/min 离心,免疫复合物又经12 000 g/min离心,最后在电镜下直接观察到典型的病毒粒子形成的免疫复合物,建立了具有3次筛选作用的改良的IEM法,具有简便、直观、快速和定性正确等优点。但由于需用电镜设备,其价格十分的昂贵,一般的实验室及猪场没有这样的条件,不适合于大规模诊断和临床诊断。

  4.2 免疫荧光法

  免疫荧光法(IF)一般分为直接免疫荧光法(FAT)、间接免疫荧光法(IFAT)和免疫过氧化物酶技术,3 种方法都可应用于实验室诊断,但前者较为常用。若 IF 或免疫过氧化物酶试验呈阳性,并伴有腹泻症状,则几乎肯定为 PEDV。较常用的是直接免疫荧光法(FAT)检测,是一种比较可靠的特异性诊断方法。在 1990 年,崔现兰等应用 FAT 检查病猪小肠的冷冻切片或小肠抹片,对 PEDV 人工感染仔猪检出率为 91.4%,电镜观察阳性率为 47.8%。应用间接免疫荧光法(IFAT) 对 PED 阳性猪血清的检出阳性率为 89%。后来,在 1997 年,林志雄等用适用于 Vero、PK-15 等传代细胞株生长繁殖的 PEDV-G1 株直接免疫免

  疫荧光法,用该方法检测来自有严重腹泻、呕吐和死亡症状的6个猪场155份仔猪肠黏膜样品,检出率为 52%,并用血清中和试验检测该6个猪场的PEDV抗体,证实被 PEDV 感染过。同时,应用哈尔滨兽研所的荧光抗体方法比较,阳性符合率达 95%,阴性符合率 90%。并不与猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒、轮状病毒和大肠杆菌等发生交叉反应。证明该方法具有较高的准确性和特异性。而朱维正等用间接血凝试验与间接免疫荧光法(IFAT)比较后认为IFAT 法更敏感。

  4.3 微量血清中和实验

  病毒活毒素与相应的抗体结合后,失去对易感动物群的致病力,称之为中和试验。林志雄等人建立了PED微量中和试验,采用适应于传代细胞生长的PEDV G1株,以PK15作指示细胞,48小时判定。研究证实本方法检验准确、可靠,具有较高的敏感性,可用于流行病学调查。

  4.4  ELISA法

  ELISA 法最大的优点就是可从粪便中直接检查 PEDV 抗原,应用较为广泛。但在 ELISA 方法出现之前,国外许多学者都是利用培养病毒的方法直接对 PEDV 抗体进行检测。如 1988年 Hofmann 等首次报道将 PEDV 适应于 Vero 传代细胞培养后,对 PED 诊断学方面的研究迅速地有了较大进展,应用于 PED 及其抗体检测的诊断试剂制备和检测方法的建立,但由于 PEDV适应细胞培养难度大及制备全病毒抗原存在潜在排毒的危险,致使现有的诊断方法仅限于实验室应用阶段尚未能大量应用于临床实践,因而急需一种安全、稳定、快速、易于制备且特异性和重复性均高的新型诊断方法的建立以适用于大批次试样的检测。用 ELISA 方法检测 PEDV 被大量应用于临床实践中,该法既可用于测定抗原,也可用于测定抗体,是国际贸易指定标准诊断方法之一。根据 ELISA 的基本原理,发展出了双抗体夹心法ELISA、竞争阻断 ELISA、间接 ELISA 以及斑点酶联免疫吸附试验法(Dot-ELISA 法)等诊断方法。

  4.5  RT-PCR法

  Ishikawa等根据S基因序列设计了一对可扩增目的片段854 bp的引物,成功的建立了诊断PEDV的RT-PCR法,可进行细胞毒和粪便毒的检测,灵敏度可达100 TCID50/mL,并可在8 h内测出。Kubota等根据N基因序列设计了一对可扩增目的片段540 bp的引物,成功地建立了诊断PEDV的RT-PCR法,可进行细胞毒和粪便毒的检测。尽管此法敏感性和特异性都很好,但由于需要特殊的仪器设备,目前只适合于实验室诊断,不适合于临床诊断。Kim O等人已建立了TGEV和PEDV的二联RT-PCR诊断方法,可同时检测出10 TCID50/mL的TGEV和PEDV。Kim O等对免疫组化、原位杂交、RT-PCR3种方法进行比较,认为RT-PCR法检测结果的重复性最好。但当被检样品为福尔马林固定时,采用免疫组化和原位杂交这两种方法更适合。此外,Kim O等还建立了鉴别TGEV和PEDV的多重巢式RT-PCR法。此方法适用于检测福尔马林固定的组织,以原位杂交法作对照,结果显示二者检出率完全一致。乔宪凤等以PEDV的膜蛋白(M)的RNA为模板,根据Durate等人发表的基因序列,设计3条位于PEDV膜蛋白(M)基因上的引物,进行RT-PCR反应,确立了RT-PCR最适反应条件,取得了预期的结果。

  5 防治方法

  暴发PED时,无特别有效的治疗措施。抗菌药物对病毒无效,但可以预防细菌性疾病的继发感染。我国预防猪流行性腹泻仍依赖于综合性生物安全措施,而疫苗(灭活疫苗和弱毒疫苗)疫苗仍是一个关键环节。该病由于发病日龄小发病急(脱水后导致酸中毒)、病死率高,依靠自身的主动免疫往往来不及。因此现行的猪病毒性腹泻疫苗大多是通过对母猪进行预防注射,从而起到“子病母防”的效果;同时也可大大减少“母乳带毒”的机会。武汉回盛推出的“二泰组合”(肠泰+绿益态)方案能显著改善母猪体况,提高母猪的抗病力,为初生仔猪疾病的防控打下坚实基础。

  本病多发于寒冷的冬季,有明显的季节性,可在每年的10月份对母猪进行两次腹泻二联弱毒苗或三联苗的防疫注射,防疫间隔20 d,以便产生有效的免疫抗体。由于本病对5周龄以上的猪引起死亡率较低,可对不同阶段病猪进行不同方法对症治疗,如投服收敛止泻剂和微生态制剂,使用抗菌药物以防止细菌继发感染,静脉或腹腔注射葡萄糖盐水和碳酸氢钠溶液以防止脱水和酸中毒等,一般都可获得良好效果。发生腹泻的猪只应让其自由饮水,以减少脱水的发生。另外,在治疗腹泻病猪时,要同时“禁口”,即降低饲料的营养浓度或控制喂料量,待症状缓解后再逐步“解禁”,恢复原先饲喂方式。笔者曾对出初产3日龄腹泻乳猪采用“恩诺沙星+肠泰+绿益态+活菌300亿”口腔灌服,效果相当理想。

  返饲是将PEDV人为地扩散到妊娠母猪舍可激发母猪乳汁中迅速产生免疫力,因而可缩短本病的流行时间。返饲效果与返饲物的病毒含量有很大关系----病毒量过少,达不到效果;反之,则易导致PED的暴发和流行,甚至造成长期持续感染。

  对于种猪场,若发现暴发PED后连续数窝的断奶仔猪中均存在PEDV,则可将仔猪断奶后立即移至别处至少饲养4周,同时暂停从外引进新猪。原场应及时消毒、空栏处理。

  另外,还应加强猪场生物安全措施,防止病毒侵入猪场内,目前流行病学调查表明本病毒主要是通过猪和人的流动而侵入猪场的。晚秋至早春寒冷季节,不要引进带毒猪,注意消毒和饲养管理,做好舍饲卫生,防止潮湿闷热,保持舍内空气新鲜。提高猪群健康水平,增强抗病力。实行“全进全出”的管理,可有效的预防此病流行。

责任编辑:宋美丽  

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