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RNA干扰及其在动物繁殖中的应用

作者:吴志焕 付秀芬 曾宪垠来源:黑龙江动物繁殖 2008年第 4 期时间:2008-11-26 12:38点击:

    RNA 干扰(RNA interference, RNAi)是生物进化过程中遗留下来的一种在转录后通过 RNA 调控基因表达的机制, 它是指在真核细胞中引入双链 RNA分子从而导致具有序列同源性的基因产生特异性基因沉默 (gene silencing)的现象 。由于 RNA干扰可以阻断特定的基因表达, 具有超越疫苗和抗病毒药物的诸多优点, 因此在阐述基因功能以及蛋白质相互作用等方面, 表现出诱人的前景。近年来随着分子生物学的发展, RNAi 的机制也不断被阐明, 同时国内外研究也证实 RNAi 技术可以为动物繁殖过程中所涉及的基因功能提供一条新的思路, 这在科研和生产实践上都具有重要的意义。

 1 RNAi的发现

       Matzke 等于 1989 年报道了启动子介导的序列同源性基因共转染烟草可引起转基因表达发生沉默。 1990 年, Napoli 和 Van der Krol 等为了让矮牵牛花的颜色更加鲜艳, 把与紫色相关的查尔酮(chalcone)基因转染到牵牛花内, 结果意外发现, 植物体的颜色不但没有变得更鲜艳, 并且连内源性的查尔酮基因也被沉默, 最终花瓣的颜色却褪掉了。当时把这种现象称为基因共抑 制 或 同 源 基 因 沉 默 (homology- dependent gene silencing) 。1994 年, 意大利的 Cogoni 等将外源性类胡萝卜素基因导入链孢菌, 结果转化细胞中内源性的类胡萝卜素基因受到了抑制。当时称这种基因失活形式为 “quelling” 现象 。 1995 年, 康乃尔大学的 Su Guo博士在试图阻断秀丽新小杆线虫 (C.elegans)par- 1 基因时, 利用反义 RNA 技术特异性地阻断上述基因的表达, 而同时在对照实验中给线虫注射正义 RNA以期观察到基因表达的增强, 但结果是二者都同样地切断了 par- 1 基因的表达途径。这与传统的对反义 RNA技术的解释正好相反。该基因组一直未能给这个意外以合理的解释。直到 1998 年 2 月, Andrew Fire 和 Craig Mello证实上述现象是由于 ssRNA中混有 dsRNA而导致的, 当通过纯化的方法把这些双链 RNA 彻底清除掉, 所得的结果与以前则大不一样, 经纯化的正义 RNA链分子完全丧失了抑制目标基因的功能, 而经纯化的反义 RNA链抑制目标基因的效能也大大降低, 而经过纯化的双链 RNA却正好相反, 能够高效特异性阻断相应基因的表达, 其抑制基因表达的效率比纯化后的反义 RNA至少高 2 个数量级, 并首次将这一现象称为 RNA干扰。

      此后, 在短短的一年中,研究证实 RNAi 现象广泛存在于真菌、 拟南芥、 蜗虫、 水螅、 斑马鱼等大多数真核生物中。随后 Wianny及 Elbashir 等报道了哺乳动物细胞的基因沉默现象, 即用小干扰 RNA (siRNA)在小鼠和人的细胞中诱导产生了特异性的 RNAi 。后来 Paddison 的试验表明, siRNA 可以稳定地抑制小鼠的体细胞和胚胎干细胞的基因表达。至此, 人们认识到 RNAi 作为研究基因功能的一种有力的革命性的工具, 在哺乳动物基因研究中有着广阔的应用前景, 尤其是在转基因动物的制备、 基因治疗、 药物开发方面具有巨大的潜力。为此 RNAi 名列 《Science》 杂志 2002 年 10 大科学成就之首,并且该现象的发现者在 2006 年也荣获了诺贝尔生理学医学奖, 从此 RNAi 成为分子生物学领域的研究热点。

2 RNA干扰的过程

 2.1 RNAi 的作用机制在对线虫、 果蝇、 植物和动物卵细胞 RNAi 现象的不断研究中, 相继发现了一些与 RNAi 作用相关的酶和蛋白, 从而使 RNA干扰的作用机制逐步被阐明。但是 RNAi 作用的确切机制尚不清楚, 目前普遍认可的是 Bass 假说。其假说具体概括为 3 个阶段(图 1)。

 ( 1) 起始阶段。

      在细胞内, 双链 RNA(dsRNA)由核酸酶Ⅲ (RNaseⅢ) Dicer 在 ATP 的参与下被处理为 21~ 23 个碱基的小 RNA, 即小干扰 RNA ( siRNA) 。siRNA RNA干扰及其在动物繁殖中的应用  ( 1.四川农业大学原子能农业应用研究室, 四川 雅安 625014; 2.四川省巴中市巴州区畜牧兽医学校, 四川 巴州 636000) 摘 要: RNA干扰 ( RNAi ) 是由短的双链 RNA降解内源的同源 mRNA而引发的转录后基因沉默现象。 RNAi 作为一种调控特定基因表达的工具, 被称为基因组的免疫现象, 已成为当前繁殖领域的研究热点之一。该文就 RNAi 的发现、 RNAi 的过程及其在动物繁殖中的应用等方面的研究进展作一概述。关键词: RNA干扰; 基因; 动物繁殖中图分类号: S814 文献标识码: B 文章编号: 1005- 2739 ( 2008) 04- 0009- 04 收稿日期: 2008- 04- 18 作者简介: 吴志焕 ( 1982- ) , 女, 河北衡水人, 在读硕士。通讯作者: 曾宪垠 xyzeng@sicau.edu.cn 9 - -黑龙江动物繁殖 第 16 卷 第 4 期 2008 年是由 19~21 个碱基配对形成的双链, 并在其 3′末端有两个游离未配对的核苷酸。研究发现, siRNA 是 RNAi 作用发生的重要中间分子, 序列与所作用的靶 mRNA的序列具有高度同源性; 双链的两端各有 2~3 个突出的非配对的 3′ 碱基; 两条单链末端为 5′ 端磷酸和 3′ 端羟基。这些是细胞赖以区分真正的 siRNA和其他双链 RNA的结构基础。 研究表明,平末端的 siRNA 或失去了 5′ 磷酸基团的 siRNA 不具有 RNAi 的功能。

( 2) 引发阶段。

      siRNA与 Argonaute 蛋白家族及其他 结 合 因 子 结 合 , 形 成 siRNA- 核 蛋 白 复 合 物 ( siRNP) 。 siRNP 在 ATP 及其他辅助因子 ( 如催化亚基) 协助下, 使双链 siRNA解旋形成 RNA诱导的沉默复合物(RISC)。RISC以 ATP 依赖的方式催化双链 siRNA解旋。推测以两种方式发生, 或是从 RISC中除去双链 siRNA中的一条链, 或是使双链 siRNA在空间保持分离。利用 R ISC内部的单链 siRNA,通过碱基配对识别与之互补的靶 RNA,并切割靶 RNA,并由 RNA酶降解, 从而导致目的基因的沉默。

 ( 3) 循环放大阶段。

      在 siRNA 诱导的 RNAi 过程中, 还存在 siRNA的循环放大过程, 以维持它的 RNA 诱导功能。 此过程推测是以 siRNA为引物,互补 mRNA 为模板,在 RNA依赖性 RNA合成酶(RdRP)的作用下, 合成新的双链 RNA, 再由 Dicer 作用,产生新的 siRNA, 完成 siRNA的放大过程, 开始新的 RNAi 循环。一般来说, RNAi 的作用机制如上所述。但不同物种的 RNA干扰机制会有一定的差异, 如植物细胞会在 RNA聚合酶 ( RdRP) 的作用下, 以外来的 RNA 单链为模板, 合成长 RNA 双链分子, 进入 RNA 干扰的通路。而哺乳动物细胞内, dsRNA分子 ( > 30 个碱基对) 常常引起非特异性的干扰素反应, 导致 mRNA翻译成蛋白质的过程停顿, 基因表达受到普遍抑制。但是, 直接把 siRNA导入细胞内, 则可以避开干扰素的激活, 进入 RNA干扰通路, 特异地降解同源序列的 mRNA分子, 同时证明了 RNAi 的机制系统普遍存在于在各种细胞内。 2.2 RNAi 的作用特点应用 RNA 干扰技术抑制特定的基因表达远远优于传统的基因抑制工具, 根本原因在于 RNA干扰是源自细胞内在的基因调节机制, 它沉默细胞基因表达具有普遍性、 高效性、 特异性和可遗传性等显著特点。 3 RNAi在动物繁殖中的应用在动物繁殖领域, RNAi 技术主要应用于研究动物生殖细胞发育和动物胚胎发育过程中重要的基因功能及其作用机制。近年来该技术在此领域有了突破性的进展, 并随着该技术的不断发展和完善, 其在动物繁殖生产实践中发挥出的作用也越来越显著。

 

3.1 RNAi 与动物的生殖细胞发育

        长期以来研究人员试图找到一种新型又有价值的技术来控制动物生殖能力, 例如在体内研究生殖细胞的发育过程及生殖细胞的活力等。但是, 多年来因为体外细胞长期培养的技术不够成熟阻碍了该研究的进行。而随着 RNAi 技术的不断成熟, RNAi 的研究将有可能使我们更全面地理解生殖细胞的发育机制。并且近年来亦有很多的相关报道, 但主要集中在卵母细胞和精子形成过程中相关基因的研究上。Wianny等首次将 RNAi 技术应用于小鼠卵母细胞研究中, 选取在卵泡中表达的 c- mos 基因作为靶基因, 通过显微注射方式导入 dsRNA, 结果与对照组基因敲除小鼠实验结果完全相同, 即 c- mos 基因表达被抑制,细胞减数分裂停滞在 MⅡ期,说明 RNAi 可以用于哺乳动物细胞基因功能研究。Crowe 等利用 RNAi 技术分析了线虫体内的 Ring finger protein- 1 (rfp- 1)基因功能, 证明了该基因与外阴的发育有关, 并且它的缺失也会影响雌性动物的排卵[19] 。Jin Han 等用 RNAi 技术证明了 Wee1B蛋白在小鼠卵母细胞中特异性表达, Wee1B 蛋白是小鼠卵母细胞中关键的特异的促成熟因子(MPF)抑制激酶, 是维持减数分裂中止所必需的[20] 。Shaoji 等首次将 RNA干扰技术应用于精子的生成过程中, 他们用电穿孔法向小鼠睾丸内导入外源的报告基因, 然后用同样的方法导入包含 siRNA的 DNA载体, 发现报告基因的表达量在各个时期均有不同程度的降低, 进一步用 RNAi 技术沉默小鼠精母细胞形成过程中编码 DNA 重组酶的内源性DMC1(Disruption ofMeiotic Control)基因, 结果显示 DMC1 基因沉默后, 精母细胞发育停滞、 不育, 此实验体系为体内研究精子发生相关基因的功能提供了一条新的思路[21] 。 Williams 等为了研究睾丸组织中的特异性基因功能, 选择了 RNAi 小鼠作为研究对象, 该研究小组利用 RNAi 对睾丸中的特异性的磷脂酶 c 基因 (PLC-ζ)进行抑制, 结果显示该基因与精子的生活力有关, 而与精子的发生过程无关[22] 。Fuente 等为了减少螨虫的数量, 对编码螨虫保护性蛋白的 4D8 基因进行 RNA干扰, 结果显示 4D8 基因不但影响了螨虫的存活力, 还大大降低了其产卵率, 最终起到了控制螨虫繁殖的作用。在此基础上该研究小组利用饲养这些生育能力低的螨虫, 然后在一定条件下释放这些螨虫, 大大减少了野生群体的数量, 相对解决了家畜和人类因螨虫而带来的烦恼 。

 3.2 RNAi 与动物的胚胎发育

        在发育过程中的不同阶段, 特异性地消除基因的功能是 RNAi 最大优点之一。诺贝尔奖得主 Fire 等在研究线虫时发现了许多小的 RNA, 其功能是使线虫的发育时间紊乱, 例如 lin4 和 let7 基因转录的小 RNA可形成发夹状前体, 此前体影响线虫的时序性表达。 Momoyo等利用 RNA干扰的特异性筛选线虫胚系发育相关基因, 为进一步研究虫体发育机制打下了基础 , 同时为研究动物胚胎发育的机制起到了重要的前导作用。Wianny等为了证实 RNAi 是否影响小鼠胚胎中的基因表达, 构建了转基因小鼠检测体系,该体系在延伸因子 - 1a ( ET- 1a)启动子调控下表达修饰型绿色荧光蛋白 (MmGFP) , 将 MmGFP 的 dsRNA注入单细胞受精卵, 体外培养 3~4 d 后, 发现未注射 dsRNA的胚胎中大量表达 GFP, 而注射组只有 6.8%表现出微弱的荧光, 说明 dsRNA可以抑制 GFP 的表达; 但在注入 c- mos 和 E- cadherin 的 dsRNA单细胞受精卵中, GFP 表达并不受影响,说明 dsRNA具有抑制的特异性。 Pekarik 等首创用 RNAi 和胚内电穿孔相结合的方法进行活体基因功能研究,采用黄色荧光蛋白(YFP) 作为指示蛋白, 用电穿孔法将 YFP 和 axonin- 1 的 dsRNA转入鸡胚,发现 YFP 和 axonin- 1 表达量明显降低。Haraguchi 等在小鼠受精卵原核中注射 Oct4 基因的 siRNA表达载体, 体外培养到囊胚期阶段检测到 Oct4 基因 mRNA 和蛋白质表达水平的下降, 且胚胎发育阻滞在囊胚期。 Khang等利用 RT- PCR 的方法检测到 epithin 在小鼠胚胎 1- 细胞到囊胚期的发育过程中一直都有表达, 通过免疫荧光实验发现 epithin 和 E- 钙黏着蛋白协同定位于致密化的桑椹胚卵裂球接触面上; 而且利用 RNAi 技术抑制小鼠 epithin 基因的表达以后, 胚胎发育停滞在 8- 细胞期, 而 8- 细胞期正是小鼠胚胎发生致密化的时期, 表明 epithin 在胚胎致密化过程中具有重要作用, 并由此推测 epithin 可能诱导胚胎致密化过程中内细胞团和滋养层细胞的分化。 赵金红等为了研究胚胎 Sry 基因的调控网络, 采用 siRNA 技术使 Sry 基因沉默, 最终确定了干扰质粒的最佳注射时间、 注射剂量, 并且干扰质粒的抑制率达 85%左右 。最近耶鲁大学的弗兰克.斯勒克应用 RNAi 技术以 C.elegant 蠕虫为研究对象, 发现某些基因几乎直接参与了对寿命长短的控制, 一种小 RNA 控制着发育时间基因, 这种小 RNA 分子和控制发育时间的基因在非常具体的阶段控制着发育时间基因, 这种小 RNA分子和控制发育时间的基因在非常具体的阶段控制着细胞的发育模式, 斯勒克小组发现如果这些基因发生了变化, 就会改变蠕虫的发育时间和阶段。

      研究发现, 基因沉默的系统传播信号与植物成花素(florigen)相似, 都能嫁接传播, 而不需要任何相应激素或其他信号分子, 都能系统转导并产生表型的改变, 这些结果可能表明基因沉默与生长发育有共同的作用机制。但由于双链 dsRNA随生物体生长发育或细胞分裂逐渐降解, 浓度下降使 RNA干扰作用逐渐失效, 不能稳定存在, 所以 RNAi 技术不利于发育晚期基因的研究。

 4 问题与展望

       RNAi 是基因功能研究的有力工具, 可用于研究动物繁殖过程中相关基因的调控机制, 从而解决了体外研究基因功能的问题。但 RNAi 在该领域的研究中仍存在一定的问题, 因为动物在体内的繁殖过程要受诸多因素的影响和调控, 其关系错综复杂, 而 RNAi 技术对生物体内含量丰富的靶基因抑制效果不是很高 , 并且目前 RNAi 机制尚未完全阐明, 尤其在哺乳动物细胞中的研究报道不多。尽管 RNAi 在动物繁殖领域仍存在一定的问题, 但随着分子生物学的不断发展, RNA 干扰相关酶类的不断发现, RNAi 将会普遍、高效地应用于动物的繁殖领域中。并且 RNAi 技术有望取代传统的基因抑制工具, 成为动物繁殖领域中研究生殖细胞与胚胎发育的有效方法和手段, 应用于繁殖性能候选基因功能的研究, 同时也为 RNAi 机制的确定具有重要意义。

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