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供体细胞对猪体细胞克隆胚胎早期发育的影响

作者:潘登科,张运海,孙秀柱,李燕,吴常来源:畜牧兽医学报 ,2006 ,37 (4)时间:2008-09-29 23:43点击:

     猪的体细胞克隆效率很低(1 %以下) , 难度也比较大。本研究利用胎儿成纤维细胞为核供体、 初情期前母猪体外成熟的卵子为受体获得了我国首例体细胞克隆猪 ,成为继英国、 日本、 美国、 澳大利亚、韩国及德国等之后获得体细胞克隆猪的国家。目前 ,人们已经利用胎儿成纤维细胞、 肾脏细胞、 心脏细胞、 颗粒细胞、 成体猪皮肤成纤维细胞等成功得到了克隆猪 ,其中胎儿成纤维细胞应用最广。

     体细胞和卵母细胞周期协调是体细胞核移植最为关键的环节。Wilmut等认为血清饥饿诱导 G0期是首例哺乳动物体细胞克隆得以成功的必需步骤 ,但后来有研究利用其它方法诱导细胞进入G1 、 G2 / M 等时期 ,也能得到克隆后代 ,这说明血清饥饿不是克隆必需的。然而 ,很多研究者在尝试新物种克隆时,首选还是用血清饥饿处理供体细胞。另外有研究者报道供体细胞类型及个体差异对核移植效率有影响。本文旨在研究供体细胞饥饿与否、 细胞形态、 细胞类型及个体对猪克隆胚胎早期发育的影响, 为体细胞克隆猪供体细胞的准备提供依据。

1   材料和方法

1. 1   试验材料

细胞和胚胎的培养器皿购自 Costar 或 Nunc 公司;DMEM/ F12和 Tryp sin购自 Gibco 公司; FBS购自 Hyclone 公司;其他药品除特殊注明外均购自Sigma 公司。

香猪胎儿取自中国农业大学实验用小型猪繁育场配种40 d的 4 岁母猪。

1. 2   主要溶液配制

1)细胞培养液(DMEM) :DMEM 粉末 13.4g溶于 900 mL Milli-Q 超纯水中 , 再加 3.7 g 的Na HCO3 , 另外添加 0.11 g 丙酮酸钠 , 3.57 gHEPES , 66 mg/ mL 青霉素钠和 100 mg/ L 的硫酸链霉素, 调p H 至 7.2~7.4 ,然后定容至 1 L ,过滤除菌 ,4 ℃保存。使用前添加 10 %的 FBS 和 1 %NEAA 构成细胞完全培养基; 2) DPBS-PVA 冲卵液:先用 100 mL Milli-Q 水加热溶解 1 g PVA , 冷却后再取 9.55g DPBS粉末 , 添加 Milli-Q 水 , 使之溶解 , 并定容至1 L。用于冲卵和配制脱卵丘液;3)DPBS液: PBS 粉末 9.7 g , 1 L 超纯水定容 , p H7.0~7.2 , 过滤灭菌 , 4 ℃保存; 4) 0.25 % 胰蛋白酶消化液: 胰蛋白酶0.25 g和0.02 g EDTA , 无钙镁 PBS溶液 100 mL , 过滤灭菌, - 20 ℃保存;5)North Carolina State University-23(NCSU-23) 见文献[ 4 ] ;6) 0.1 %透明质酸酶(w/ v) ;7)融合/激活液 : 0.25 mol/ L 甘露醇 , 0.1 mmol/ L CaCl2 ·2H2O ,0.1 mmol/ L MgCl2 ·6H2O , 0.5 mmol/ LHEPES , 0.01 % PVA (w/ v) , 调 p H 为 7.2~7.4后用 Milli2Q H2O 定容至100 mL , 渗透压为253~268 mOsm ,过滤分装 , 4 ℃ 保存;8)成熟液:NCSU-23 添加 10 % (体积比) 猪卵泡液 ( PFF) , 0.57mmol/ L 半胱氨酸, 10 ng/ mL 表皮生长因子( EGF) , 10 IU/ mL 人绒毛膜促性腺激素( HCG) 和10 IU/ mL 孕马血清促性腺激素( PMSG) 。成熟液为无BSA 的 NCSU-23。

1. 3   胎儿成纤维细胞系的建立

中国农业大学实验用小型猪配种 40 d 后 ,安乐死(无痛苦屠宰)后取整个子宫 , 2 h 内运回实验室.从子宫内取出胎儿, 含抗生素 DPBS清洗胎儿 , 转移到超净工作台内 , 参照孙秀柱等组织块法建系。

1. 4   供体细胞的细胞周期同期化

诱导体外培养细胞进入 G0 / G1 期的方法有多种 , 常用血清饥饿法和接触抑制法。血清饥饿:细胞接种密度 1 ×10^5/ mL ,DMEM+ 10 %FBS + 抗生素培养 2 d , 将培养液更换为DMEM + 0.5 % FCS +抗生素 , 继续培养 2~6 d。

接触抑制:接种细胞之后,每 3d 更换一次培养液 ,直到细胞长满 ,100 %汇合。

操作步骤:将经上述处理的细胞先吸去旧的细胞培养液 ,再用无钙、 镁离子的 DPBS 洗涤 3 遍 ,添加 2 mL 0.25 %胰蛋白酶使细胞脱壁 ,加入酶液 3倍体积的含血清的细胞培养液终止消化 , 1 000r/ min ,8 min 离心去上清液 ,按每管10^6个细胞分装到 15 mL 离心管中 ,用无钙、 镁离子的 DPBS 悬浮洗涤 2 次。用约 500μL 无钙、 镁离子的DPBS重新悬浮细胞 ,边振荡 ,边缓慢加入 3 mL 4 ℃预冷的75 %乙醇或者无水乙醇 ,过夜固定(4 ℃, > 12 h) 。1 000 r/ min , 8 min 离心去乙醇 ,之后用无钙、 镁离子的DPBS + 1 % FCS沉淀、 重悬洗涤2 遍 ,用200μL 无钙、 镁离子的 DPBS 重新悬浮细胞 ,加入含0.2~1 mg/ mL RNase 的无钙、 镁离子的 DPBS1mL ,37 ℃,30 min。1 000 r/ min ,8 min 离心留沉淀 ,用 200μL 无钙、 镁离子的DPBS重悬细胞 ,加入含 100μg/ mL PI ,0.1 %Triton X - 100 的无钙、 镁离子的DPBS 1mL ,室温下 5~10 min 即可上机检测 , 上机前用 500 目(30μm)细胞筛过滤。

1. 5   体细胞核移植

1. 5. 1   供体细胞准备  

培养代数为 5~10 代的胎儿成纤维细胞 ,当细胞长到 70 %~80 %汇合时 ,用0.5 %血清饥饿处理细胞 2~5 d ,或等细胞生长到80 %以上汇合时 ,按常规方法消化 ,用无钙DPBS洗细胞 2 遍后待用。

1. 5. 2  卵母细胞的体外成熟

 从屠宰场取卵巢 ,放入 28~35 ℃, 含青霉素和硫酸链霉素的生理盐水中 , 2 h 内运回实验室。用配有 18 号针头的 20mL 注射器抽吸卵巢上 3~6 mm 的卵泡。将抽取液放入37 ℃ 水浴 50 mL 离心管中。在体视显微镜下 , 挑选卵丘包裹 3 层以上 , 致密 , 而且胞质均匀的卵丘细胞 - 卵母细胞复合体 (Cumulus2 oocyte2complexes , COCs) , 用成熟培养液洗涤 3 遍再转入在培养箱中至少已经平衡 4 h 的培养液微滴内(每100μL 液滴放 25 枚) , 矿物油(胚胎级) 覆盖。将COCs先在成熟培养液中培养(20 ±2) h , 然后转移到无 HCG以及 PMCG的成熟液中继续培养(20 ±2)h。在成熟培养终止后, 将 COCs转移到含 0. 1 %透明质酸酶的 DPBS中, 用 100 mL 移液器吹打 2~5min脱去卵丘细胞。在体视镜下挑选卵黄膜完整、 卵周隙清楚、 排出第一极体的成熟卵母细胞待用。

1. 5. 3   体细胞核移植显微操作  

利用盲吸法进行成熟卵母细胞去核 , 即在直径 60 mm 培养皿盖中央做一个长方形的 50μL 显微操作液滴( Hepes2NCSU-23 + 7. 5μg/ mL CB) , 再用矿物油覆盖。把供体细胞以及成熟卵母细胞同时转入其中于39 ℃,5 %CO2 , 100 %湿度平衡 15 min , 然后在装配有显微操作仪及恒温台的倒置显微镜上用固定吸管(内径 10~20μm , 外径 100~120μm)吸持卵母细胞 ,用内径15~25μm的去核/注射针吸取第一极体及其临近 10 %~20 %可能含有卵母细胞核的胞质。挑选直径15~20μm , 折光性强、 圆形、 光滑的体细胞 , 从去核切口放入卵周隙。每批操作 30 个卵母细胞 , 结束后将供体细胞 - 卵胞质构成的细胞对(重构卵)转移到 NCSU-23 + 4 mg/ mL BSA 中 , 39℃, 5 %CO2 , 100 %湿度培养箱中恢复 1. 5 h。

1. 5. 4   重构卵融合与激活  

将恢复好的重构卵分批转移到融合液中平衡 20 s , 洗涤 3 遍后 , 每批 5个放入已经铺满融合液的融合槽内(电极宽度为500μm , 美国B TX公司产品) , 使供体细胞 - 受体卵细胞膜接触面与电极平行 , 用 ECM2001 融合仪(B TX)施加 1 个 30μs , 2. 0 kV/ cm 的直流电脉冲诱导融合同时激活 , 再用 NCSU-23 + 4 mg/ mLBSA 洗涤 3 遍 , 立即转入矿物油覆盖的胚胎培养液中 , 39 ℃, 5 %CO2 , 100 %湿度培养 0. 5~1 h 后取出 , 在体视显微镜下判定融合。

1. 5. 5   体细胞核移植胚胎体外培养  

将融合的重构胚用胚胎培养液洗涤 3 遍后 , 转入预先做好并至少平衡4 h 的矿物油覆盖的胚胎培养液滴内(NC2SU-23 + 4 mg/ mL BSA)继续培养。每个 30μL 的液滴培养8~10 个重构胚。在培养48 h 和144 h 时记录卵裂和囊胚形成结果。


1. 6   试验设计

试验 1 : 细胞周期同期化处理对核移植效率的影响 

 用血清饥饿法诱导供体细胞进入 G0 / G1 期 ,70 %汇合度的细胞做对照 ,比较它们的克隆胚胎卵裂及囊胚率的差异。

试验 2 : 细胞形态对核移植效率的影响

体外传代培养用于核移植供体的细胞 ,其形态分为圆形光滑的和圆形但表面粗糙的(图 1) 。比较这 2 种细胞做供体细胞时核移植胚胎体外卵裂以及囊胚率。

 

白色箭头示圆形光滑的供体细胞;黑色箭头示圆形但表面粗糙的供体细胞

White arrow point to round and smooth donor cells ;Black arrow point to rough surface donor cells

图 1   猪胎儿成纤维细胞

Fig. 1  Porcine fetal f ibroblast cells

试验 3 :供体细胞类型对重构胚的融合率及囊胚发育的影响

传代培养的 3 种类型体细胞:胎儿成纤维细胞、耳成纤维细胞和颗粒细胞为核供体 ,比较它们对重构胚的融合率和囊胚率的影响。

试验 4 :不同个体胎儿成纤维细胞对囊胚发育的影响
以来自 2 个体 SW3FF 和 P3FF 的胎儿成纤维细胞为核供体 ,比较不同个体对核移植效率的影响。

试验结果以统计分析软件 SAS8. 2 的 t 检验进行分析, P < 0. 05 时为有显著差异。

2   结   果

2. 1   胎儿成纤维细胞对细胞周期同步化处理的反应

细胞同期化处理:血清饥饿法和接触抑制法诱导细胞进入 G0 / G1 期 ,流式细胞仪分析细胞周期如图 2 和表 1 所示 , 方差分析发现各组间不存在显著差异。

2. 2   细胞周期同期化处理对核移植效率的影响

当使用 70 %汇合分裂旺盛时期收获的细胞做供体时,克隆胚囊胚率与血清饥饿处理组之间没有显著差异(表2) , 但是其胚胎卵裂率高于血清饥饿组( P < 0.05 ,64.4 % vs 50.5 %) 。

 

2. 3   细胞形态对核移植效率的影响

尽管在融合率上 , 圆形光滑细胞显著高于表面粗糙的细胞组( P < 0. 05) , 但克隆胚胎的卵裂以及囊胚形成率上却没有显著的差异(表 3) 。

 

2. 4   供体细胞类型对重构胚的融合率及囊胚发育的影响

 

由表 4 可以看出 ,胎儿成纤维细胞和颗粒细胞为核供体的核移植胚的融合率无显著差异(72.7 %vs. 81.5 % , P > 0.05) ,但与耳成纤维细胞的对应结果差异显著 ( 62. 8 % , P < 0.05) 。3 种类型细胞重构胚的囊胚率差异不显著( P > 0.05) ,但颗粒细胞为核供体的囊胚率显著低于胎儿成纤维细胞和耳成纤维细胞 ( 5. 6 % vs. 12. 8 % , 9. 4 % , P <0.05) 。

2. 5   同日龄不同个体胎儿成纤维细胞对囊胚发育的影响

由表 5 可以看出 ,同日龄不同个体的胎儿成纤维细胞 SW3FF和 P3FF 的重构胚的囊胚率(5.9 %vs. 15.3 %) ,差异显著( P < 0.05) 。

3   讨   论

在已经被用于成功获得克隆动物的供核体细胞中 , 胎儿成纤维细胞是应用最广的。尤其在进行生产转基因 , 基因敲除等基因组修饰的大动物克隆时 , 胎儿成纤维细胞则是首选。 因为胎儿成纤维细胞在体外培养生长可以在较长时间内保持正常的染色体倍性而不发生转化 , 留给人们较多的时间进行转基因操作和后继的阳性细胞筛选。


体细胞与受体卵母细胞的细胞周期阶段协调是克隆成功的最关键因素之一。 体细胞与去除核物质的卵母细胞构成克隆胚胎后 ,保持正常倍性至关重要 , 只有倍性正常才能进一步发育。一般认为血清饥饿诱导细胞进入 G0 期对重新程序化有益, 尽管这种处理不是获得克隆动物所必需的。目前 ,人们已经利用了除 S期之外的其它阶段的细胞得到了后代。诱导体外培养细胞进入 G0 / G1 期的方法有多种 , 常用血清饥饿法和接触抑制法。Kues等发现血清饥饿 2 d后再进行饥饿 , G0 / G1 期细胞比例不会再有显著增加 , 反而会造成许多细胞走向凋亡 , 或染色体异倍性增加。接触抑制是一种高效、简单的 G0 / G1 同期化方法 ,但是不同类型细胞或不同来源细胞对其敏感性不一。本研究比较了这两种方法诱导 G0 / G1 期的效率 ,发现二者差异不显著;另外血清饥饿 2 d 和 4 d 差异不明显 , 同样接触抑制 2 d和 4 d差异也不显著。这提示我们 , 在诱导G0 / G1 期时 , 要 2 d 就行了。当然 , 对克隆效率的影响还需要进一步深入研究。关于细胞周期的作用现仍旧争议较大。最初 ,Dolly的主要研究者 Wilmut 和 Camp bell 等认为血清饥饿诱导细胞进入 G0 期是他们获得成功的不可或缺的环节。之后 ,随着人们相继利用其它的方案获得 G1 、 G2 / M 期细胞的克隆后代 ,Camp bell 表示 ,他从来就没说过处于其它细胞周期阶段的细胞就不能得到克隆后代 ,而只是说 G0 期有利于得到克隆动物。有意思的是 ,血清饥饿仍是当前进行克隆研究的学者们的最流行的方法。截至目前 ,尚未有任何一种同期化方案可以提供 100 %同步期到某一细胞周期阶段细胞。

血清饥饿 48 h 即可使 80 %以上的细胞同步到G0 / G1 期 , 延长饥饿时间并不能显著提高细胞 G0 /G1 的比例。而且饥饿超过 48 h , 细胞出现大规模DNA 片段化(这意味着凋亡的发生)的比例增加。

和 Kuhholzer, Hyun和 Koo的结果相同 , 我们的研究也表明血清饥饿处理对囊胚的早期发育影响没有明显的促进。不过还需要深入的研究以弄清楚血清饥饿对附植后体内发育是否有好处。

尚不知这些细胞周期同期化处理后对体细胞的一些表观遗传学机制是怎样的影响。在牛上 ,已经有人注意用一些表观遗传学修饰试剂处理后检测了体细胞的DNA 甲基化以及组蛋白乙酰化水平。所以 ,将来可以进一步利用类似的方法来监测细胞周期同期化之后的表观遗传学变化。


Lai等研究选择 G2 / M 期的细胞作为供核细胞 , 发现处于 G2 / M 期的供核细胞能在去核 MII期的猪卵母细胞中重新编程 , 其额外的染色体以第 2极体的形式排出卵母细胞 , 同时成功获得了体细胞克隆猪。因此 , 从目前研究状况说明 G0 期或 G2 /M 期的供核细胞都能有效地在胞质受体中进行正常核编程。现在一般认为除了 S期外 , 其它时期的细胞都可以作为核供体。


Wang认为粗糙的细胞使重构卵的融合率下降, Tao发现表面粗糙的细胞克隆胚胎的原核形成率明显降低。本研究似乎不支持 Tao 等的结论 ,我们发现圆形而且表面粗糙的细胞做供体只影响融合效率 ,不影响卵裂、 囊胚形成。


在克隆牛中发现 ,卵丘细胞做供体 ,克隆效率高于成纤维细胞,这似乎说明体细胞克隆效率有一定的组织特异性。本研究结果表明供体细胞的类型对猪体细胞核移植的囊胚率有显著影响;不同个体的同一类型细胞重构胚囊胚发育率存在差异 ,这与龚国春的报道一致。

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