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猪传染性胸膜肺炎研究进展

作者:唐文山来源:动物医学进展时间:2008-09-15 10:54点击:

       猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia,PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,App)引起的一种猪的呼吸道传染病。各种年龄、性别的猪对本病均易感,其中以1周龄~4月龄的猪易感性高,病死率可达5%~30%。在新引进猪群中多呈急性暴发,发病率和死亡率都在20%以上,最急性流行死亡率高达80%~100%。自Pattison等于1957年首次报道后,欧洲、美国、加拿大、澳大利亚、墨西哥、日本、韩国和中国台湾等国家和地区均有此病发生。我国在20世纪80年代初期,由于养猪方式大部分以分散饲养为主,本病发生较少。20世纪90年代开始,随着集约化养猪业的迅速发展,加上国家及地区间引种工作的日益频繁,本病的发病率及死亡率大大高于从前。国内大多数省(区、市)经病原学、血清学诊断和检疫,有此病发生的报道。说明PCP在我国已广泛流行,并有扩大蔓延之势[1]。早期确诊和接种能控制PCP的流行[2]。传统的诊断方法和疫苗都存在着不同程度的缺陷,由于App血清型较多(共15个血清型),不同的血清型之间没有或仅有较弱的交叉保护力,这就给PCP的预防和控制带来一定困难。虽然一些药物能有效治疗该病,如先锋霉素、阿莫西林、头孢噻呋(ceftioful)、替米考星(timicosin)、四环素、氯霉素等。但经常使用药物,容易使App产生耐药性,而且长期用药还会导致药物残留,使肉品质量下降,影响人类健康和经济发展。抗生素的治疗虽在临床上能取得一定效果,但不能消除猪群的带菌状态。

1 病原

App属放线杆菌属,是革兰氏阴性、有荚膜的多形球杆菌,有时呈线性,无鞭毛,不运动,不形成芽孢。在室温下可存活2 d~4 d,4 ℃存活7 d,-25 ℃可存活2个月。根据培养时是否需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD,又称V因子),可将App分为生物Ⅰ型和生物Ⅱ型,生物Ⅰ型为NAD依赖株,包括血清型1型~12型和15型,其中1型又可分为la和lb两个亚型,5型又可分为5a和5b两个亚型;生物Ⅱ型的生长不依赖NAD,但需要其他特定嘌呤或嘌呤前产物以辅助生长,含有2个血清型,分别为血清型13和14[3­4]。App的血清型是根据表面荚膜(CP)和脂多糖(LPS)抗原性的不同来划分的,但有些血清型有相似的细胞结构或相同的LPS链。这可能是部分血清型,如血清1、4、10和11型;3、6和8型;4、5和7型等之间存在血清交叉反应的原因[5­6]。

App引起猪发病与较多的毒力因子有关,包括LPS、外膜蛋白(OMP)、转铁结合蛋白(TBP)、CP、溶血外毒素(ApX)、蛋白酶和渗透因子等。OMP的抗体具有调理活性,是App的一种重要保护性抗原,其参与免疫的主要抗原是分子质量约为42 ku的外膜脂蛋白(OML),它为巴氏杆菌家族所共有;在宿主体内,ApX可以产生一种对肺泡巨噬细胞起毒性作用的物质,可抑制肺泡巨噬细胞的吞噬活性。同时,ApX对外周单核细胞及淋巴细胞也有细胞毒性作用,被认为是引起感染并使肺组织严重损伤的主要原因[7]。另外,App的荚膜对巨噬细胞及补体都有抵抗能力,在白细胞介素­1(IL­l)、白细胞介素­8(IL­8)及干扰素(INF)的作用下,可引起早期的肺组织损伤。因此,细胞毒素的作用是引起肺组织病变的主要原因。

App由于荚膜结构、LPS成分和溶血外毒素类型的不同,各血清型的毒力不尽相同。Jacobsen等试验证实,生物Ⅰ型菌的毒力比生物Ⅱ型菌的强,产生相同病变的最低菌数,生物Ⅰ型是104  cfu/mL,生物Ⅱ型是109cfu/mL。一般认为,生物Ⅰ型中血清1、5、9、10型和11型比其他血清型的毒力强[8]。

2 流行病学

病猪和带菌猪是本病的传染源。猪与猪之间的密切接触和排泄污染物是本病传播的主要途径[9]。当App通过空气传播时,只有在1 m内的易感猪才能感染。本病的发生受外界因素影响很大,猪群的转移或混养可增加PCP发病的危险。其他如拥挤和气候剧变、潮湿、通风不良、饲养密集、管理不善条件下等均会加速该病的传播。

北美地区的流行血清型为1、5、7型;欧洲多为2、3型和9型;在亚洲,日本多见2型和5型,韩国则为2、4、5、7型,台湾地区主要为1型和5型,而中国大陆已分离或检测到抗体的血清型有1、2、3、4、5、7、8、9型和10型[10­11]。

3 临床症状

最急性型者一个或几个猪群突然发病,病猪体温升高到41.5℃,精神委顿,食欲明显减退或废绝,张口呼吸,呈犬坐姿势。发病后期出现心衰和循环障碍,耳、鼻、眼及后躯皮肤发绀。晚期出现严重的呼吸困难和体温下降,病猪临死前从嘴、鼻孔流出血性泡沫样液体。病猪于24 h~36 h内死亡,死亡率高达80%~100%。急性型:同圈或不同圈猪同时发病,病猪精神沉郁,咳嗽,呼吸困难,体温升高至40.5 ℃~41.0 ℃,初为鼻、耳、腿部皮肤,继而全身发绀。整个病程稍缓,通常发病后2 d~4 d死亡,也可能转为亚急性或慢性。

亚急性或慢性型者通常由急性转化而来,病猪体温不升高或略有升高,有不同程度的自发性或间歇性咳嗽,食欲不振,精神欠佳,增重缓慢,成为危险的带菌者。当受到严重应激或其他病原微生物侵害时(如肺炎支原体、多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌等),则临床症状加剧。

4 病理变化

其病变主要表现为不同程度的肺炎和胸膜炎。肺炎大部分为两侧性,涉及心叶及尖叶和部分膈叶,膈叶上的病灶常常是局部的,而且界线分明。在迅速死亡的猪体内,气管、支气管中充满泡沫状、血性黏液及黏膜渗出物,有时可见肺表面有大量的出血和淤血斑。在最急性型的后期,肺炎区色暗、坚实、切面脆弱。随着病程的延长肺部病灶会逐渐变小,肺炎区常见大小不同的结节,这些脓肿样结节被一层厚结缔组织膜包裹,胸腔内有血液样液体。大部分的慢性病例,肺都可见胸膜表面被覆有弥漫性纤维素性渗出物。

5 诊断

5.1 病原的分离鉴定

App主要存在于猪鼻腔、气管、扁桃体、肺部组织及分泌物中,急性感染还可能存在于其他脏器中。该菌属兼性厌氧,在加有V因子的琼脂培养基上培养24 h~48 h,可形成直径为1 mm~2 mm的不透明菌落,菌落扁平,用接种环触之有黏性感。在牛、羊血琼脂上,产生β溶血。App可发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖,产酸不产气,个别菌株可发酵乳糖、甘露醇、木糖、阿拉伯糖;能使尿酸酶斜面变成粉红色,VP试验阴性,MR试验阴性,硝酸盐还原试验阳性,产生硫化氢,不利用柠檬酸盐,CAMP阳性。App不发酵碳水化合物,醋酸铅试验呈阴性反应。

5.2 血清学检测方法

5.2.1 补体结合试验 1971年,Nicolet建立起针对App感染的补体结合试验(CFT),由于其特异性高于间接血凝试验(IHA)[9],能够将副溶血嗜血杆菌感染与App感染区分开来,因此,很快成为App分型的标准方法。朱士盛等[4]于1987年用CFT诊断PCP获得了满意的效果,混合抗原与单价抗原的敏感性和特异性比较,一般前者比后者高1倍。因此,最佳混合抗原的应用有利于该病的流行病学调查。然而,与平板凝集、ELISA等检测方法相比,其操作繁琐、费时费力,一般只在实验室进行。

5.2.2 凝集试验 凝集试验(agglutination test,AT)中使用的抗血清采自于接种了App抗原的兔子。如果是2­巯基乙醇试管凝集试验,抗血清用盐水或0.1 mol/L的2­巯基乙醇连续稀释。试管凝集试验需要反应18 h,而玻片凝集试验的阳性反应通常在2 min~3 min内便可看出结果。此法适用于新分离菌的鉴定和分型,操作简便,但无法判定抗体效价[3]。

5.2.3 间接血凝试验 Nielson报道间接血凝试验(indirected hemagglutination assay,IHA)在血清6和8型之间有交叉反应,但它能将血清型4和7分开。国内逯忠新等[10]报道,经戊二醛­鞣酸化处理的绵羊红细胞用胸膜肺炎放线杆菌抗原致敏,以IHA检测猪传染性胸膜肺炎病猪血清抗体。致敏红细胞抗原的最佳浓度为100 μg/mL~150 μg/mL,超免血清的抗体效价达1∶512~1∶1 024,对人工感染14 d的猪血清阳性检出率达80%。与猪瘟、猪肺疫、猪喘气病、猪萎缩性鼻炎阳性血清无交叉反应。本检测方法适用于猪传染性胸膜肺炎流行病学的调查和定性。IHA具有敏感、特异和可早期诊断的特点,且操作简单,适合于在生产中推广应用。

5.2.4 酶联免疫吸附试验 酶联免疫吸附试验(enzyme­linked immunosorblent assay,ELISA)方法敏感性好,简便,快速,可方便的用于临床诊断、实验室检测和血清学调查。用于检测App的ELISA方法主要有两种,一种是Nicolet J等建立的ELISA代替CFT作为App的分型方法;另一种是种特异性ELISA,由于ELISA对抗原纯度要求很高,因而对其改造主要在于抗原的纯化[11]。以原核表达的ApXⅡ的重组蛋白作为抗原,建立特异性的ELISA诊断方法,因ApXⅡ在除10型外所有的血清型中都可以表达,所以,该方法理论上可以对几乎所有的App感染做出检测。用此方法共检测了400份血清,其中阳性243份,阴性157份。检测结果与CFT试验的相关性很高,且敏感性也比CFT高。

5.2.5 其他血清学检测方法 用于App诊断的其他血清学方法还有乳胶凝集试验(latex aggtutination test,LAT),免疫扩散试验(immunodiffusion test,IT),环状沉淀试验(ring preipitation test,RPT),间接荧光抗体技术(indirect flurorescent antibody test,IFA)等。

5.3 分子生物学检测方法

Frey J等[12]建立的PCR检测方法,是通过不同的引物对扩增App毒素的激活基因和结构基因ApXI CA、ApXⅡC、ApXⅢCA以及部分分泌基因ApXI BD、ApXⅢBD的一个特征部分。不同的引物对在两个不同的PCR试验中分别扩出2条和3条扩增带,根据扩增产物长度的不同,进行分辨和确诊。

王牟平等[13]根据已发表的AppⅣ毒素的基因序列,设计合成了2对引物,建立了套式PCR方法,App血清1、2、5、6、7、9型均可扩增出448 bp和365 bp的特异性条带。套式PCR检测的灵敏度可达50个细菌,最低检出DNA浓度可达58.5 pg/mL。作者对5株从病猪体内分离的App进行了检测,均为阳性;对10头屠宰猪的肺脏分离物进行了检测,结果1份为阳性。据此认为,此PCR方法特异性和灵敏性均很高。

6 防控方法

猪传染性胸膜肺炎发生呈递增趋势,且以多发性浆膜炎和关节炎及高发病率和高病死率为特征,影响猪生产的各个阶段,给养猪业带来严重损失[13]。疫苗免疫是控制App感染的有效手段,实行疫苗接种,可提高猪体的特异性免疫抵抗力。抗体具有较好的保护作用,母源抗体可以保护仔猪5周~9周。

6.1 灭活苗

灭活苗不能刺激动物产生高滴度的抗体,当动物受到感染时,临床症状和肺的损伤都会出现[14]。灭活苗为血清特异性,Fenwick B W等[15]研究表明灭活苗对其他血清型的保护很有限,对异种血清型的感染基本上不能提供保护。

Eiji O等[16]研制出了APPl、2和5型三价混合油佐剂灭活苗,逯忠新等[10]也研制出了App血清1、3、7型三价灭活苗,分别进行了临床试验,结果表明,免疫效果得到了一定程度的提高。罗马尼亚取得专利的疫苗是由灭活的和被吸附的App(40%)、多杀性巴氏杆菌(30%)和支气管败血博代菌(30%)混合培养物研制的三联苗,也取得了较好的效果[17]。

6.2 亚单位苗

研究表明,l型App的细胞抽提物的保护力比灭活苗和外膜脂蛋白的制剂更好,其细胞抽提物的主要成份是11 ku的溶血素[18]。用经福尔马林灭活的1型或5型的细菌与纯化的ApX Ⅰ共同免疫小鼠,不仅对其相应的血清型起到了完全的保护,而且彼此之间具有交叉保护力[19]。在App的急性感染中,ApX和OmlA在提供保护方面起着至关重要的作用。

近几年,对App的主要毒力因子进行分子生物学分析,通过研究App的毒素分子致病机理而研制出一种更为有效的亚单位疫苗[20]。研究表明,ApxIN­末端40个~280个残基的片段被用作亚单位疫苗时,可诱导出对异种血清型的致死性感染的保护力[21];App的荚膜多糖溶血素蛋白和脂多糖溶血素蛋白联合疫苗能激发机体的免疫应答,可抵抗App的内毒素、外毒素和溶血活性毒素[22];Richand对App的外膜蛋白(OMP)免疫原性进行了研究,发现针对至少4种OMP的抗体对至少9种血清型中的多数细菌有交叉保护作用[23]。可见,App的OMP有望成为预防该病的有效疫苗。

6.3 弱毒疫苗

自然康复猪可以抵抗所有血清型的感染。这就提示可以研制弱毒疫苗用于免疫,从而获得高效的保护力。

App温度敏感突变株、荚膜多糖缺陷、核黄素营养缺陷型和脲酶阴性表型突变株均可作为减毒疫苗的候选[23]。Rosendal S等[24]将一株1型的App在体外传代70次,使其荚膜从原来的137 nm减少到53 nm,而其他成分Oml、Apx都末发生变化,结果荚膜变薄菌株的毒力已减弱,这与Inzana的研究结果一致。Inzana用乙基甲硫酸对App进行诱变,得到荚膜完全缺失的突变株。以大于亲本株LD50的量经气管接种动物,并没有出现临床症状和肺损伤,而且对动物产生了很好的保护力。荚膜不能对动物提供充分的保护,但荚膜却为App的毒力所必需[15]。所以荚膜缺失的菌株在毒力减弱的同时,并不影响其保护力。

总而言之,较理想的App疫苗应该是以毒素为主要成分的亚单位苗或毒素失活而非缺失的基因工程苗。由于弱毒疫苗可以激发良好的抗体反应和交叉保护力,而且使用方便成本低,是今后App疫苗的发展方向[25]。但近年来应用较多的是亚单位疫苗和灭活苗。制备灭活苗时,应选择当地分离的具有较强毒力的优势血清型菌株来制备,因其可以提供较为充分的菌体及毒素抗原,产生最大限度的保护。而在亚单位疫苗的制备过程中,要注意不同的抗原成分最好使用不同的血清型菌株制备,以最大限度的提高疫苗的交叉保护性。

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