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关于蓝耳病免疫的是是非非

作者:樊福好 农业部种猪质量监督检验来源:畜禽业 2005年第6期时间:2005-07-24 16:27点击:

 猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome ,以下简称PRRS,蓝耳病),是一种以引起母猪繁殖障碍和各日龄猪呼吸疾病为特征的接触性传染病,其病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒(以下简称PRRSV,蓝耳病病毒)。
    关于猪蓝耳病的免疫,科学界虽然取得了一系列的研究成果,但也存在着许许多多我们尚未知晓的秘密,因此造成学术界和养猪行业内的争论也此起彼伏。这其中不乏商业利益的驱动,但最终也反应了人们对蓝耳病疫苗接种所具有的疑虑和对蓝耳病认识上的种种差异。
1关于蓝耳病病毒的起源
    许多新的人类和动物的疾病由RNA 病毒引起,这些病毒大约出现在过去的40 年中,这些先前就已存在的病毒(preexisting viruses)在一定的条件下感染了补充宿主(alternate hosts), 如埃博拉病毒(Ebola virus),汉坦病毒(Hantavirus),尼巴病毒(Nipah virus), 亨德拉病毒(Hendra virus) 等。由于一开始就没有弄清楚原因,蓝耳病病毒引起的疾病曾经也被称为“神秘猪病(mystery swine disease)”, 直到后来才发现它同样也是一种RNA 病毒,其与鼠乳酸脱氢酶升高病病毒,马动脉炎病毒,猿出血热根据ORF5 绘制的遗传进化树病毒等都属于动脉炎病毒科。由于欧洲型和北美型的蓝耳病病毒基因组序列的差异分离达40% 之多,蓝耳病病毒的起源就成了一个非常有趣的话题,Peter G.W. Plagemann 推测说,该病毒是由鼠的动脉炎病毒(乳酸脱氢酶增高病毒,lactate dehydrogenase-elevating virus)通过伤口感染了中欧的野猪(Wild boars )后产生的变异病毒,这些野猪曾作为狩猎使用被引进美国,被引进的野猪就作为中间宿主将病毒传播至北卡罗来纳州,感染的时间大约发生在1912 年。这些病毒在这两大洲内独立变异和进化,大约经过七十年左右的时间,通过家猪和野猪的接触,病毒进入家猪(domestic pigs)群中,形成了后来的两大独立的蓝耳病病毒原型(即通常所说的蓝耳病病毒的两种基本的基因型):欧洲型(以Lelystad 为代表,简称LV)和美洲型(以VR-2332 为代表,简称VR)。欧洲和北美在1991-1994 年间从野猪体内检测到蓝耳病病毒的抗体也证实了这一点。
    回顾性检测也同时发现美国的爱荷华州在1985 年, 明尼苏达州在1986 年,东德在1988-1989 年的猪血清中发现了蓝耳病病毒的抗体,而在1985 年之前爱荷华州以及德国的家猪血清内却并未检测到相应的抗体。

 

    图1 根据ORF5 绘制的遗传进化树
2 蓝耳病病毒的感染
    一般认为,巨噬细胞(macrophages) 是肺脏主要的或唯一的感染蓝耳病病毒的细胞,但后来的研究发现,肺泡的二型肺细胞(pneumocytes type II) 也可以感染蓝耳病病毒。尤其有趣的是,该病毒还可以感染生精小管(seminiferous tubules )的上皮生殖细胞(epithelial germ cells) 和间质内的巨噬细胞,并导致精细胞的缺损和死亡(一种细胞程序性死亡,apoptosis),而大量的未成熟的精细胞便成了蓝耳病病毒的携带者;同时该病毒也感染卵巢卵泡中的巨噬细胞。由此导致公猪的精子数量下降或非正常精子比例升高,公猪精液成了持续性排毒的来源,而当母猪使用这些精液时,往往不能受孕。
    呼吸与繁殖器官便成了蓝耳病病毒的主要感染部位,看来蓝耳病真的是大自然(上帝)对高密度饲养和人工授精技术的一种“惩罚”。这个事实给予行业的启示是,我们不能仅仅看到人工授精技术是清除疾病的重要手段,也要看到该技术也是加速疾病传播的重要媒介,许多新技术的应用是要我们付出代价的,我们必须研究新的应对措施,比如精液的安全检测技术等。蓝耳病病毒在感染时不但能发生变异,而且变异发生的频率异常之高(Lager & Mengeling,1999 & 2000)。由于蓝耳病病毒是一种RNA 病毒,象其它的RNA 病毒(流感、口蹄疫、猪瘟)一样,变异是RNA 病毒的一个非常明显的特征。在自然界中,科学家已经分离了成千上万种不同的蓝耳病病毒的分离毒株(以下简称毒株)。但要记住,变异(Mutations )和重组(Recombinations )不是一个概念,完全是两码事,将两个不同分离株的蓝耳病病毒混合感染单个细胞虽然在实验室里产生了重组的毒株。自然界中也曾报道发现了重组的蓝耳病病毒毒株,但最终也没有被完全证实。蓝耳病病毒绝对不会象流感病毒那样容易进行重组。那么两种分离株的病毒同时进入一个机体后的结果会是什么呢?实验已经证实,这两个毒株的其中一个将逐渐占据优势地位,成为唯一能够繁殖的毒株,而另外的毒株则最终消失,但机理尚不太清楚。而且两个毒株的差异越大,两者之间不相容的程度就越高。这一点或许可以解释我国至今没有欧洲型的毒株,可能是在我国美洲型的蓝耳病病毒毒株“人多势众”,欧洲型毒株无处插足。
3 猪的免疫系统
    为了进一步理解猪蓝耳病病毒的免疫,我们有必要回顾一下猪的免疫学现象。
    与人类和其他哺乳类动物一样,猪的免疫系统也包括两个部分,即先天性免疫系统(Innate immune systems )和获得性免疫系统(acquired or adaptive immune systems)。这两个系统是相互依赖的两个部分,它们共同完成机体控制微生物感染的作用。先天性的免疫系统可以非特异地识别外来抗原和微生物,有大量的效应细胞和分子来完成该功能,但对于重复感染则不具备增强反应的功能。而获得性免疫反应是一种特异性对抗特殊病原或抗原的反应,淋巴细胞是主要的效应细胞,可以产生记忆性反应,对再次感染可以产生增强性的免疫反应。
    猪的免疫系统的细胞也主要来源于骨髓,主要的免疫相关细胞主要包括髓样细胞(myeloid)、单核细胞(monocyets)、巨噬细胞(macrophages)、树突状细胞(dendritic cells)、嗜中性细胞(neurtophils)、嗜酸性细胞(eosinophils)和嗜碱性细胞(basophils) 以及淋巴细胞(lymphocytes )等,其中, 淋巴细胞主要包括两种主要的类型:B 淋巴细胞和T 淋巴细胞。淋巴细胞主要在骨髓(B 细胞)和胸腺内(T 细胞)发育成熟,这两个器官是初级免疫器官(Primary lymphoid organs)。而真正的免疫学反应是发生在外周免疫器官(Secondary lymphoid organs),外周免疫器官包括淋巴结(lymph nodes)、脾脏(spleen)、派尔氏结(Payer’s patches,一种肠内的淋巴集结)及各种各样的黏膜相关淋巴组织。
    当病原微生物突破先天性免疫系统的时候,机体的获得性免疫系统将开始发挥作用。我们必须明确的是,机体在利用各种各样免疫机制阻止和控制感染以及疾病的同时,病原微生物也同时形成了各种各样的对抗方法来确保它们在机体内的繁殖和存活。一旦病原微生物逃脱了机体的免疫系统,猪只就会生病。比如猪只在感染蓝耳病病毒时,蓝耳病病毒一方面可以减少白细胞介素-10(IL-10) 的产生,也可以减少γ-干扰素(IFN-γ) 的产生,从而进一步减少细胞介导的免疫反应。了解这些原理就可以帮助兽医师们制定各种策略来帮助免疫系统对抗病原和疾病,使猪只免于生病。
另外,猪的免疫系统在胎儿期开始萌发直到出生后4~8 周才发育得较为完全,随着生长,免疫系统还在不断完善之中。所以在子宫中感染猪瘟病毒或蓝耳病病毒,但出生时仍存活的猪将会变得比较虚弱,往往在断奶之前死亡,或成为持续的带毒者,而出生后早期感染蓝耳病病毒的猪往往呈呼吸症状。在母猪怀孕后期感染则表现为严重的繁殖障碍,在非孕期或怀孕早期则症状不明显,这些观察结果表明随着日龄的增加免疫反应将逐渐增强(但当感染严重损伤免疫系统时,则机体的免疫效果将会不明显)。所以,很多人认为仔猪在出生时免疫系统就已经相当成熟的观点是值得商榷的,而以此提出的零时免疫(超前免疫,乳前免疫)的做法也要认真反思。
4 蓝耳病免疫的机理
    蓝耳病病毒感染后抗原特异性的体液免疫最初出现在感染后的7 ~10 d,中和抗体则在感染后14 到28 d才出现在血清中。抗蓝耳病病毒的IgM 抗体在病毒接种后的5 ~7 d将会出现,在2 ~3 周后将检测不到其存在;抗蓝耳病病毒的IgG 在病毒接种后的7~10d首先被检测到,在2 ~4 周后达到顶峰,将会持续数月,到300d左右降低到低水平;抗蓝耳病病毒的IgA 将在病毒接种14d后才在血清中被检测到,在25d到达最大值,35d后则不能被检测到。
    机体在感染流感病毒后会引起有效的免疫反应,产生细胞因子和干扰素,并且在一周内快速消灭流感病毒的感染。而猪在感染蓝耳病病毒后6~7 周才能观察到病毒血症的出现,最初的反应却不是产生干扰素及相关的细胞因子。
    蓝耳病病毒是一种非常“聪明”的病毒,它可以逃避免疫系统的监视,使机体延迟产生保护性的抗体或其他免疫因子的时间达4~6 周之久,有些猪只甚至成为病毒的携带者,持续不断地释放病毒达3~4 个月, 即使是那些胎盘内感染的仔猪出生后也可以成为病毒的携带者。蓝耳病病毒在猪体内的持续性存在提示了该病毒可以导致免疫系统发生了重要的改变。
    体外培养的实验中发现,在有蓝耳病病毒抗血清存在的情况下,蓝耳病病毒感染肺泡巨噬细胞的能力被显著提高;在攻毒前若给猪注射中和抗体,病毒血症的平均水平和持续时间比注射正常IgG 的猪要严重得多。所以,可以推测,某些抗体实际上也许会增强蓝耳病病毒在巨噬细胞中的复制,即抗体在一定程度尚引起了有害的且没有保护力的应答反应。这种反应也被成为抗体依赖的增强作用(antibody-dependent enhancement, ADE),在ADE 中,血清抗体不但不能中和病毒,反而会提高感染的严重程度,这一点与猫的感染性腹膜炎( feline infectious peritonitis) 和人的登革热(dengue fever )是非常相似的。
    以上事实说明,肺部的蓝耳病病毒感染与其他组织的病毒感染在机理方面确实存在着一定的差异性。这同时也是蓝耳病免疫机理中一个引人注目的地方。
5 蓝耳病的疫苗免疫问题
    根据经验,已经接种过疫苗的动物在受到野毒侵袭时,会出现一个较高水平的血清抗体,这主要是由于野毒入侵以及先前畜群疫苗接种带来的免疫记忆反应。在蓝耳病的免疫中,人们先前也是认为,蓝耳病病毒进入机体后会引起感染,引起循环抗体以及记忆性的T 淋巴细胞和B 淋巴细胞的增加,而且认为这些抗体和淋巴细胞可以阻止感染的进一步发生。但后来发现这些想法大部分都是错误的。如果这些想法是错误的,那么现行的检测蓝耳病毒抗体方法的意义又必须重新评价,这些抗体只能是衡量感染的指标,这些抗体对蓝耳病的病因追索和在研究、评价疾病控制方案中会起着重要的作用,但却不是衡量机体免疫保护的指标。到目前为止,尚没有用来分析和预测机体受保护的免疫学方法,至于中和抗体有无中和作用仍有争论。
    蓝耳病存在两种基本的基因型(欧洲型和美洲型) ,所以就存在同源免疫( Homologous immunity)和异源免疫(Heterologous immunity )的概念。由于疫苗、或野毒、或诊断试剂盒都是基于一个或少数遗传差异的病毒,对一个病毒能够产生免疫,却不一定会对另外的病毒产生免疫,或诊断反应也不具备通用性。然而,在蓝耳病病毒中,两个基因型间却具有较宽的交叉免疫反应。虽然国内外在蓝耳病的同源免疫和异源免疫方面做了很多实验,但实验结果却差异很大。总之,分子遗传学分析表明,蓝耳病病毒的保守氨基酸序列存在于所有的蓝耳病蛋白质中,这是交叉免疫反应的物质基础所在。
    关于接种蓝耳病弱毒苗和灭活苗的争论也很多。毋庸质疑,灭活苗的安全性是大高于弱毒苗,而且不存在散毒的危险,然而再好的灭活苗的效果也是不能和弱毒苗相比较的,否则弱毒苗就根本没有存在的必要了。在蓝耳病的灭活苗使用中,如果没有合适的高效的免疫佐剂,要想得到好的免疫效果,目前在国内来看,也只能是纸上谈兵。但有些学者认为,蓝耳病弱毒疫苗免疫后会对母猪的繁殖性能和公猪的精子活力造成影响,所以弱毒苗的安全性和效力不可靠,不主张接种弱毒疫苗。实际上,任何疫苗的使用都会象药物一样不可避免地产生一定的副作用,灭活苗也是一样(因为其中含有的佐剂会存在一定的副作用,比如国内使用的口蹄疫疫苗等)。当然,如果一个农场的生物安全工作能够做到完美无缺,则任何疫苗都不必使用,否则就必须使用有免疫效果的疫苗(无论是活苗还是死苗),不过这种短期内造成的损失应该是在可以容忍的范围之内。
    研究表明,蓝耳病病毒的弱毒苗(或活苗)在减轻临床病症的严重性方面,病毒血症的持续时间上,以及病毒扩散和蓝耳病病毒感染的频率上是非常有效的,自然产生的中和抗体(而不是前文所说,注射的中和抗体)在抵抗二次感染和保护或减少病毒在动物中的传播也起到重要作用,因为这些中和抗体和其它因子共同作用是可以在循环系统中清理病毒的。
    另外,理论上一般都认为,在母源抗体高时接种疫苗,母源抗体会“中和”掉一部分疫苗,仔猪就不能产生坚强的免疫力,所以在实践中,人们要等到母源抗体下降到一定程度时才给猪只接种疫苗,殊不知,仔猪此时却出现了免疫的空白期(或者叫窗口期),病原体则乘虚而入。而人们在对仔猪实行乳前免疫时也发现,母源抗体高时仔猪很容易出现过敏反应,这也从另外一个侧面说明了母源抗体实际上是促进了仔猪机体免疫反应的发生,而不是象很多人认为的那样母源抗体会“中和”掉疫苗,况且疫苗接种后的效果并不能完全靠抗体水平的高低来衡量,抗体水平没有出现大的升高并不能说明该疫苗或该疫苗的接种程序有问题,因为机体本身的免疫背景是决定抗体水平高低的重要因素。在蓝耳病的疫苗接种中,我们再也不能模拟猪瘟的那种接种模式(即所谓“乳前免疫”或“ 断奶时免疫”或“断奶后免疫”), 具体机理,这里不在赘述。
6 猪场内蓝耳病病毒的净化策略及评价
    从单个猪群(尤其是种猪群)中净化/ 清除(elimination/eradication )蓝耳病病毒是完全可能的,常用的方式是检测/淘汰法(Test & Removal method)(Dee et al, 2000)。在进行该方法之前,所有的经产母猪至少封闭4 个月,此阶段不引进任何后备猪,后备猪在场外饲养2~4 个月。对那些没有进行场外饲养的农场,要结合保育猪和生长-育成猪的清群计划。当经产母猪群的抗体阳性率≦15% 时,所有的经产母猪须全部进行检测。检测的方法是用Elisa 和PCR 两种方法结合使用,检测/淘汰程序如表1。
表1 猪场蓝耳病检测/淘汰程序
ELISA PCR 猪群状态 采取措施
+ + 感染 淘汰
+ - 感染/曾经感染 淘汰
- + 感染 淘汰
- - 没有感染 保留
    为了使整个猪群能够尽快施行净化策略,采用全群疫苗接种的方法以取得一致的免疫水平也是值得考虑的方式之一,因为接种疫苗后,蓝耳病病毒将找不到可以寄生的宿主。
    另外,一个蓝耳病阳性的,经过接种疫苗的,稳定的母猪群,也是产生蓝耳病病毒阴性猪群的良好来源。研究发现,这些母猪的后代在离场饲养的时候,其中的母源抗体(maternal PRRS titers) 会在经过4 个星期左右后消失。保育结束以后,这些后代猪群将成为蓝耳病阴性猪群。而那些没有接种疫苗的,不稳定的母猪群的后代在进入保育猪群后是携带蓝耳病病毒的,不能产生阴性猪群。所以,一个稳定的母猪群是非常重要的。
    但是,我们必须强调的是,猪群中蓝耳病病毒净化以后,整个猪群将成为更加易感(na.ve herd) 的猪群,通过我们已知的和未知的途径,蓝耳病还有可能会卷土重来。一个完全清群(depopulation) 的猪场,可以引进蓝耳病阴性的猪群来进行建群(repopulation), 但发现经过引进后备猪或精液一段时间以后,病毒还是回来了。
    那么引进完全阴性的后备猪又怎么样呢?听起来这是一个非常不错的主意,但由于蓝耳病病毒的自然属性,很多经产母猪是病毒的持续释放者,实验证实,于感染213 d后还是可以在经产母猪的扁桃体内发现蓝耳病病毒(Bierk et al,2000)。所以世界上绝大多数的兽医科学家认为,引起蓝耳病病毒的循环传播的主要途径仍然是不断引进新的猪群(尤其是易感猪群)。
研究还发现,无论是蓝耳病病毒阳性的猪群,还是蓝耳病病毒阴性的猪群,只要都是在进行闭群饲养(Close Herd TM System) 时,两者之间并无差异,甚至阳性猪群的某些生产性能还高于阴性猪群,如高的配种率、高的母猪年产活仔数,低的弱仔数等。这一事实也是值得生产实践的借鉴的。
    总之,在养猪业中,由于人类对猪只生长干预得越来越多,我们实际上是在培养对疾病越来越易感的猪只。比如,在采用高床饲养的过程中,该程序在开始实施时的断奶猪表现出了超乎寻常的生长和健康优势,但经过三、四个代次以后,后备母猪体内的抗体种类和相应的免疫记忆细胞的种类越来越少,仔猪所获得的母源抗体和其他因子的种类也随之下降,断奶后的问题却接踵而至。蓝耳病阴性的猪群就象高床的使用一样给我们带来的也只能是更加易感的猪只。
7 猪用疫苗使用的总体策略
    我们必须承认,疫苗在保护动物和保护人类方面永远是起着积极作用的,这一点无庸质疑。但在当前的养猪行业内,存在着一股潮流,疫苗、血清和药物铺天盖地,这些东西好象成了保证猪只健康生长的灵丹妙药,养殖场简直成了猪的医院,整个养猪行业被各种各样的疫苗、血清和药物包围着,已经到了不堪重负的地步。
    长期使用抗生素,细菌产生了耐药性,人类已经为此付出了重大的代价,有识之士早以为此振臂高呼。那么长期大量使用疫苗的后果又会是什么呢?动物机体和病原体会不会同样产生“耐苗性”或者“抗苗性”呢?细菌和病毒在疫苗的选择压力下,通过自然选择,巧妙改装,最终还是成为威胁目前养猪业的强者。例如,猪瘟疫苗的不规范使用已经造成了一种进退两难的境地。所以,我们必须记住:疫苗和药物的使用一样,充其量只是一种手段,是一种暂时控制疾病的手段,而不是目的,并不是养猪业生产中不可分割的部分。在使用疫苗时,我们一定要讲究策略,既不能“麻痹大意”, 也不能“谈虎色变”,“ 因噎废食”, 要因地制宜,因场制宜,因时制宜,还要因猪( 群) 制宜。
    同样,蓝耳病疫苗的使用也不例外。彻底告别蓝耳病的困扰是整个养猪行业的共同心愿,这个结果需要通过大家的一起努力才能做到。
    综上所述,大体介绍了当前学术界对蓝耳病免疫问题的各种不同观点,其中所涉及的评论仅代表作者个人观点,无意与某些标准发生冲突,其中的错误与偏颇请读者自鉴,欢迎批评指正(fanfuhao@china.com)。

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