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精液稀释:不同方法的比较

作者:来源:时间:2008-06-10 15:02点击:

作者:W.E. Morgan Morrow,北卡罗莱纳大学 - 在所有种公猪管理当中,良好的精液处理措施都是非常重要的一环。“预稀释”则是最近逐渐受到重视的一项措施,就是在精液稀释的过程中先加少量稀释剂,然后再加入全部稀释剂。


Dr Morgan Morrow
猪兽医专家

编注

在最近加拿大多伦多举行的美国猪兽医年会上,Deborah Murray和明尼苏达大学的三个同事Darwin Reicks博士、Chris Kuster博士和Bob Morrison博士对经过预稀释的精液和未经预稀释的精液进行了对比。以下是他们的研究报告。

介绍

种公猪精液预稀释的目的主要是为了减轻精子的冷休克。影响精子功能的因素包括采精温度、存储温度和悬浮媒介1。精液温度如果突然从体温降至15℃以下,就会出现冷休克,精子活力会降低2,可另一方面精液采集之后又必须尽快稀释。另外,预稀释情况下先加入少量(100ml)稀释液,然后再加入全部稀释液,让渗透压有一个逐渐变化的过程。预稀释会让新鲜精液迅速获得抗生素的保护。一般公猪精液当中都含有细菌,浓度最高可达到1093cfu/ml。

然而,预稀释需要花费更多的时间。与预稀释相比,一次性全部稀释可节省时间,而且只需操作一次,错误操作的风险较低。本研究的目的就是要搞清楚,在授精效果方面,预稀释处理的精液与未经预稀释的精液之间是否存在显著的差异。

材料与方法

试验精液采自69头相同环境下饲养的不同日龄的杂交终端公猪。用徒手带橡胶手套进行采精,精液采入3.8升的塑料采集袋中,采集袋置于预热过的杯子里,袋内装有纱布过滤器。对精液进行称重,根据重量来估计一次射精的精子数。

对盛放精液的塑料袋进行按摩(为了使样品均匀一致),用吸管吸取一滴精液到预热过的载玻片上,置于相衬显微镜下检查精子的活力。根据精子活力将精液评定为合格或不合格。如果不合格,就将精液弃置。

用移液管吸取100微升精液,置于2.4ml柠檬酸钠溶液中,混合均匀,然后用多通道显微红外快速成像系统(IMV Microreader)来检查精子浓度。对样品中形态异常的精子进行计数(数25格),根据异常精子的比例对精子浓度进行了校正。校正过程不考虑附着原生质滴的精子比例。根据校正过的精子浓度,决定该次射精的精液可分成多少份授精剂数,以及总稀释容积应为多少。然后对公猪号、采精人员、采精总容积、每毫升精子数(百万)、尾部卷曲精子的比例(%)、附着原生质滴的精子比例(%)、死亡精子比例(%)等情况进行记录。

精液置于恒温装置中,维持在37℃。采精2分钟后,将精液取出恒温装置,等分为两份。一份加入100ml稀释液,标为E;另一份不加任何稀释液,标为O(表 1)。之后将两份精液重新放回恒温装置。采精6分钟后,按计算好的稀释容积将两份精液完全稀释。分别从两份精液中各取一滴滴于载玻片上,置显微镜下检查精子活力。精子活力大于70%的为合格,小于70%的为不合格。如果E、O当中任何一份不合格,就将两份精液全部弃置。然后将2到5份完全稀释的精液按E组和O组混合,再检查精子活力。然后用Cryovet自动包装机将混合后的精液包装好,贴上标签。经过预稀释的精液贴上红色标签,未经预稀释的精液贴上蓝色标签。包装好的精液在室温下冷却30至45分钟,然后转入16℃的环境中。

表 1: 稀释剂分组和稀释时间
E组 1: 2分钟时用100ml稀释剂预稀释 2: 6-8分钟时加入其余的稀释剂
O组 6-8分钟时加入全部稀释剂

精液完全冷却之后,就可以拿到母猪场去授精了。从每份混合精液里流出一份样品,分别于24、48、72、96和120小时对样品进行测评。如果上述任何时间发现某份混合精液的品质不合格,就通知母猪场,将该份精液弃置。

精液被派发到5家母猪场(共计1,700头母猪),每家猪场接到的O组和E组精液剂数相同。各家猪场按自己的操作规程进行精液处理、发情检查,并对母猪进行人工授精。试验过程中各家猪场仅采用试验精液,直到试验精液用完为止。所有精液都在采集后5天之内用完。各猪场用相同剂数的O组和E组精液进行授精,双号的母猪用E组精液授精,单号母猪用O组精液授精。本试验中一共用了98份混合精液。

统计分析

研究开始之前,我们做了统计鉴定力分析,要想鉴定出分娩率上5%的区别,每个处理需要大约985头母猪;要想鉴定出窝产仔数上0.5头/窝的区别,每个处理需要大约645窝(鉴定力=0.80,置信概率=0.05)。试验抽样为母猪。自变量为处理(也就是精液处理技术)。因变量为受胎率、分娩率和总窝产仔数。采用罗杰斯梯回归分析来检验不同处理对受胎率有无影响。对窝产仔数做了方差分析,对分娩率做了卡方分析。通过在窝产仔数和分娩率的分析当中加入适当的因子,可利用多重回归和罗杰斯梯回归来对结果的一致性进行验证。

结果

用经过预稀释的精液授精的母猪受胎率(87.7)与用未经过预稀释的精液授精的母猪受胎率(91.8)之间差异不显著(置信概率P=0.12;危险系数比OR=1.26,95%置信区间CI为0.94至1.70)。试验总共分析了1,666头母猪、1,288窝仔猪的数据。两组处理之间分娩率(76.5%,78.1;P=0.46)和窝产仔数(11.73,11.63;P=0.58)均无显著差异(表 2)。

表 2: 授孕结果
处理 分娩率 (标准误) N (分娩率) 总产仔数 (标准差) N (总产仔数) 繁殖性能指数
预稀释 76.5% (1.5%) 838 11.73 (3.04) 641 897
未预稀释 78.1% (1.4%) 828 11.63 (3.38) 647 909

罗杰斯梯回归分析证明两种处理之间分娩率没有显著差异(P=0.27;OR=1.07,95% CI:0.83至1.05)。对窝产仔数进行多重回归分析的结果(全回归决定系数R2=0.10,P=<0.0001)也一样,预稀释与未预稀释精液之间差异不显著(P=0.86)。然而,两组之间窝产仔数的方差却存在显著差异(P=0.0054,图 1)。

结论与应用

预稀释和未预稀释精液授精所得的分娩率和总产仔数均无差异。因此,在完全稀释之前先进行预稀释是没有效果的。省去预稀释的步骤,可节省精液处理的人工。如果预稀释每份精液需要多用30秒,那么对于每天需要对100头公猪进行采精的猪场来说就是50分钟左右。每周就是5.83小时,每年303小时。按每小时工资10美元算,每年需要多花费的人工成本就是3,000美元左右。

省去预稀释步骤,还可以降低操作过程出现错误的风险,比如称量过程的错误、精液倾洒,或者同一份精液被预稀释了两次,或忘记预稀释,从而造成稀释比例不准确。

然而,预稀释精液与未预稀释精液授精后得到窝产仔数之间的方差存在着显著差异,说明这个问题上仍需要进一步研究。

参考资料

1 Johnson, L.A., Weitze,K.F., Fisher,P., and Maxwell,W. M.C. “Storage of boar semen”,Animal Reproduction Science 62:1-3, pp. 143-172. August 2000.

2 Ibid.

3 Althouse, G.C., Kuster, C.E., Clark, S.G., and Weisiger, R.M. “Field investigations of bacterial contaminants and their effects on extended porcine semen”,Theriogenology 53:1167-1176. 2000.

4 Kuster, C.E., Althouse, G.C., and Schaeffer, D.J. “Statistical and biological significance in the use of marketed ‘Long-term’semen extenders”,In: Boar Semen Preservation IV, eds. L.A. Johnson and H.D. Guthrie, Allen Press, Inc., Lawrence, Kan., 129-135,2000.

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