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乳铁蛋白的研究进展及应用前景

作者:来源:时间:2008-06-10 15:02点击:

 摘 要 乳铁蛋白(LF)是一种多功能的糖蛋白,具有抗菌、抑菌、抗病毒、抗氧化、调节机体免疫和提高肠道对铁离子的吸收等作用。通过对乳铁蛋白的生产制备和基因调节作用的阐述,讨论乳铁蛋白在饲料添加剂中的应用前景。
    关键词 LF;生理功能;基因调节;应用
    中图分类号 S816.7

    我国的养猪业发展迅速,但抗生素等药物的添加导致动物性食品中药物残留问题日益严重。因此,寻找一种安全、环保和高效的新型抗菌制剂已成当务之急。乳铁蛋白 (Lactoferrin,LF)是一种相对分子量约为80 000Da的铁结合性糖蛋白,主要存在于乳汁、眼泪、唾液、精液、鼻腔分泌物等外分泌液或血浆、中性粒细胞中[1]。乳汁,尤其是初乳中LF的含量很高,如牛初乳中的LF质量浓度为1g/l[2]。深入研究发现,LF是一种具有多种生物学功能的蛋白质,它不仅参与铁的转运,而且具有抗菌、抑菌、抗病毒、抗氧化、调节机体免疫和提高肠道对铁离子的吸收等作用,被认为是一种新型的抗菌、抗癌药物和极具开发潜力的食品和饲料添加剂[3-5]。
1 乳铁蛋白的分子结构
    Groves于1960年首次从牛乳中分离获得LF, 由于LF与铁结合形成红色的复合物,故也称其为“红蛋白”。人和牛的LF一级结构具有高度的相似性,二者同源性高达69%,牛和人的LF分别含有689和691个氨基酸[6]。由已确定的人LF的完整高级结构和牛LF的部分高级结构相比可见,LF的二级结构是由α-螺旋和β-折叠交替排列组成的。Anderson等用X射线分析法测定了结晶状态下的人LF二级结构的组成;徐跃用傅氏转换红外线光谱仪测定了重水溶液和粉剂状态下的脱辅基牛LF的二级结构组成。两个结果显示,人和牛的LF二级结构以α-螺旋和β-折叠结构为主(70% 以上),同时α-螺旋多于β-折叠。Baker等用X射线分析法建立了人LF的完整立体结构,发现人LF的立体结构包括两个结构基本相同的叶,N 端的叶叫 N 叶,由1~332个氨基酸残基组成;C 端的叶叫 C 叶, 由334~703个残基组成。每个叶又包括两个结构域和一条裂隙,裂隙是结合Fe3+的部位,每个LF可以结合两个Fe3+和两个碳酸根离子。LF是糖蛋白,所有的LF分子都含有基本结构为双杈状的多聚糖,该多聚糖与肽链上的天冬氨酸残基相连,不同来源的LF多聚糖在结构和组成上仅有细微的差别。
2 乳铁蛋白的功能和作用机理
2.1 乳铁蛋白具有广谱抑菌作用
    1972年,Bullen等首先提出LF具有抑菌作用。乳铁蛋白对革兰阴性菌和阳性菌的抑菌作用,一方面是由于乳铁蛋白高度结合铁,使细菌失去生长所需的基本养分铁;另一方面,乳铁蛋白通过氨基末端强阳离子结合区域,增加细菌细胞膜的通透性,使细菌的脂多糖从外膜渗出,起到直接杀菌作用。现已确定,LF属广谱抑菌剂,既可抑制需铁的革兰氏阴性菌,如大肠菌群、沙门氏菌等;也可抑制革兰氏阳性菌;但基本不抑制对铁需求不高的菌,如乳酸菌[6-11]。
2.2 乳铁蛋白具有抗病毒作用
    乳铁蛋白通过抑制病毒进入细胞,减轻对人体肝细胞的损害。肝细胞病毒C(HCV)是一种有囊膜的单链RNA病毒,它可以引起慢性肝炎、肝硬化、肝癌。LF可通过结合在肝细胞病毒C的囊膜蛋白上阻止病毒与靶细胞结合。轮状病毒感染最容易引起初生婴儿和儿童的非细菌性胃肠炎,全世界每年平均有一百万儿童死于轮状病毒感染。轮状病毒(Rotavirus)的基因组是包裹在3层衣壳内的10段不同的RNA片段。Superti等(1997)研究发现,LF可阻止轮状病毒吸附于靶细胞上,从而防止感染,而且在病毒进入靶细胞后,LF仍然有抗病毒效果,但具体机理目前尚不清楚。LF在体外没有直接抗FVC(Friend virus complex)感染的效果, 因此,其作用机制可能是作为一个转录因子促进了骨髓组织生成(Fleet, 1995)。LF对艾滋病(HIV)病毒也有抑制作用,Defer、Muller等发现,艾滋病患者的血浆、唾液中LF水平明显下降,所以他们更容易感染其它疾病。Viani等(1999)报道,LF与叠氮羰基结合后能够增加LF抗HIV病毒效果。LF对HIV病毒的作用主要发生在感染的早期,可能是在病毒吸附到靶细胞上时,如果在感染后给药,给药越晚LF的作用越弱,而且金属元素饱和的LF对HIV病毒的作用比空白LF的作用弱,其原因尚不清楚。除此之外,LF抑制herpes simplex virus(HSV)、cytomegalovirus(CMV)等病毒。几乎所有的研究都表明,LF阻止病毒感染细胞不是在感染后阻止病毒复制,而是直接结合于HCV、Polio、轮状病毒、HSV以及HIV病毒粒子上而阻止其感染靶细胞。也有研究表明,LF无直接抗病毒效果,而是通过间接地调节免疫系统的抗病毒反应来达到抗病毒的目的。
    铁离子是几乎所有细菌生长所必需的物质(是细菌生物氧化酶所必需的),而LF能够夺取细菌生长所需的Fe3+。嗜中性粒细胞是含LF最多的细胞,在未释放到血液中时LF未结合铁离子,当释放到血液中后便有较强的结合铁离子的能力, 因而具有较强的抑菌作用。有研究表明,当LF培养基中加入Fe3+时,随Fe3+浓度的加大抑菌作用减弱,当加入过量的Fe3+抑菌作用完全消失,这证明LF通过与细菌竞争铁离子达到抑菌的目的。也有研究者认为,LF通过与细菌竞争结合位点来抑制细菌。
LF还具有直接的杀菌能力。Ellison等报道,LF可粘附于细菌胞膜上,通过改变膜的通透性而使细菌死亡;LF可以导致革兰氏阴性菌外膜中脂多糖的释放,从而改变胞膜的通透性。LF还具有杀真菌的能力,尤其是对假丝酵母属作用的研究报道较多。这些抗细菌和真菌活性不仅仅靠夺取病原体微环境中的铁离子,而且还通过以其N-端结合细菌和真菌的细胞壁破坏细胞膜,导致细胞内容物的泄露来杀死它们。
2.3 乳铁蛋白具有抗氧化作用
    研究结果显示,乳铁蛋白能抑制铁诱导的脂质过氧化过程所产生的硫代巴比妥酸和丙二醛的生成。另外,牛乳铁蛋白能降解酵母中的转运RNA,具有核糖果核酸酶的活性,且能抑制超氧离子的形成。所有这些都可降低人体内自由基对动脉血管壁弹性蛋白的破坏,达到预防和治疗动脉粥样硬化和冠心病的目的。
    人和牛的LF都已被发现有抑制脂质过氧化的作用,因此,LF用作食品和饲料添加剂可以起到抗氧化剂的作用。
2.4 乳铁蛋白具有抗癌作用
    铁与其它微量元素的平衡,在补充机体缺铁,降低铁在机体内沉积引起的铁过负荷,以及由此引发的一系列临床疾病中均发挥重要的预防和治疗作用。另外,乳铁蛋白对消化道肿瘤,如结肠癌、胃癌、肝癌、胰腺癌,具有化学预防作用,并可抑制由此引发的肿瘤转移。最后,乳铁蛋白能启动宿主防御系统的初始活化反应,调控不同类型淋巴细胞比例的改变对机体免疫反应的影响,在提高免疫力、预防丙型肝炎病毒的感染和治疗慢性肝炎方面都起到了积极作用。
2.5 乳铁蛋白调节机体免疫反应
    据报道,LF可以促进中性粒细胞或巨噬细胞的杀菌作用和吞噬作用,对NK细胞的活性和淋巴细胞、中性粒细胞的繁殖具有调节作用。在一般情况下,每毫升血清中含有LF 0.3~0.5μg,但一旦发生感染,LF将从活化的嗜中性粒细胞中释放到血液中,放出量可增加到平时的20倍,因此,LF可被视为抗炎因子。据日本的角田研究小组报道,他们做了鱼类LF的防御感染效果试验,将金鱼预先用添加0.4% LF的饵料分别饲喂3d和14d,再和患白斑病的金鱼一起用普通饵料饲喂10d,结果对照组的存活率为20%;而用添加LF的饵料预先饲喂3d的组存活率为60%;预先饲喂14d的组存活率为80%。在口服LF对金鱼血液性状影响的试验中发现,淋巴球数随着饲喂天数的延长而增多。
2.6 乳铁蛋白调节胃肠道对铁的吸收
    乳铁蛋白通过它的氨基和羧基末端两个铁结合区域能高亲和性地、可逆地与铁结合,并维持十二指肠细胞在一个较广的pH值范围内对铁元素的吸收和利用。
2.7 乳铁蛋白同药物的协同作用
    研究显示,乳铁蛋白能同多种抗生素和抗病毒药物协同作用,减少药物用量,降低抗生素或抗病真菌制剂对人体肝、肾功能的损害,同时,增强体内微生物对药物的敏感性。
2.8 基因调节作用
    乳铁蛋白的转录可由雌激素在其基因的3个不同部位进行调节,还可能通过其mRNA的3端非翻译区富含腺嘌呤和尿嘧啶的不稳定序列进行转录性调节[12]。乳铁蛋白自身可能也是一种其它基因表达的调节物质,乳铁蛋白可同一些特异DNA序列结合并调节一定的基因表达,这些现象揭示了外源性乳铁蛋白可发生细胞内转化并被转运至核质部位,但作用机制尚不清楚。后来发现乳铁蛋白对纤维母细胞内GM-CSF有下行调节作用,特别当受IL-1刺激时,这种下行调节作用更为明显,这些报道支持了上述说法[15]。
    另外,对乳铁蛋白基因结构及其表达调控的研究也取得了很大进展。人乳铁蛋白(hLF)的基因全长2.35kb,其中有一个2 133bp的开放阅读框架(ORF)、编码分泌信号肽(19个氨基酸残基)和成熟的乳铁蛋白(692个氨基酸残基)[16,17];猪LF基因定位于猪2号染色体长臂的2q12区域,编码19个残基组成的分泌信号肽和685个氨基酸组成的完整蛋白,在体外转录、翻译后产生一个78kDa的蛋白[18,19];LF在异源生物体中的表达特征及可能的应用前景越来越引起人们的关注[20-22]。
3 乳铁蛋白的生产工艺
    自1960年以来,人们就尝试采用各种方法制备乳铁蛋白,例如采用色谱法、超滤法、盐析法以及酸沉淀法等从人或牛乳中分离纯化LF(姬德衡,1996)。目前,随着分离精制技术不断完善,已在工业上成功地开发了从干酪乳清和脱脂乳中制备纯度高达95% 以上的LF,其生产技术要点是组合使用膜技术和色谱分离技术(山内恒治,1999)。利用超滤(ultrafiltration,UF)技术制备乳铁蛋白制品的生产工艺(于长青,1999)见图1。

    用该工艺制备乳铁蛋白的回收率可达70%左右,浓缩倍数达2.7倍,操作简便,生产成本相对较低,易于工业化生产;缺点是制备的乳铁蛋白纯度低,膜需要经常处理。
我国每年有大量乳清和8~10万吨富余牛初乳[13,14]可用于生产乳铁蛋白,在现有的基础上进一步优化工艺、降低生产成本,形成工业化生产,就能实现乳铁蛋白的商品化。
4 应用前景
    新生仔猪普遍存在的贫血和腹泻是导致其死亡的主要原因。LF能促进铁的转运和吸收,可以治疗仔猪贫血;具有广谱的抗菌、抗病毒作用,可用来预防和治疗仔猪腹泻。所以促进母猪乳汁中产生内源性LF或增加仔猪日粮中的LF,将是预防仔猪腹泻和贫血的最佳选择[23]。此外,IF还具有调节免疫系统活性的作用,能增强家畜对疾病的抵抗力;具有抗真菌和抗脂质氧化作用,可用作防霉剂和抗氧化剂;具有耐高温特性,使其在饲料加工过程中不易变性失活。总之,LF具有广泛而独特的生物学功能和理化特性,在乳品、食品、生化、医药、化妆品等领域,特别是饲料行业开发前景广阔。由于乳铁蛋白为动物初乳中的天然蛋白质,因此,必将为绿色畜牧业发展发挥其应有的作用。

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